消化器癌の遺伝子異常の網羅的探索とそれらをターゲットにした標的治療の臨床への応用

2011 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 23790800
• 研究機関: 札幌医科大学
• 研究代表者: 能正 勝彦 札幌医科大学, 医学部, 助教 (10597339)
• 研究期間 (年度): 2011-04-28 – 2013-03-31
• キーワード: 大腸癌 / microRNA

研究概要

(1) Pyrosequencing法により大腸腫瘍におけるKRAS、BRAF、PIK3CAの遺伝子変異を検出 　大腸癌・大腸ポリープの臨床検体のパラフィン標本からDNAを抽出。それらを用いてKRAS（codon 61、146）、BRAF（V600E）、PIK3CA (exon 1、9、20) の遺伝子変異を検出する。その方法として高感度Pyrosequencing technologyを用いるが、primerやdispensation orderは独自に作成。大腸癌・大腸ポリープにおける遺伝子変異のより正確な頻度を解明し、epidermal growth factor receptor (EGFR) 標的治療薬剤であるCetuximab やPanitumumab等の感受性を検討する。また遺伝子変異のみならず大腸発癌に関わる遺伝子のメチル化やゲノムワイドDNAメチル化の指標となるLINE-1のメチル化レベルも検討する。(2) microRNAやDNAを用いて大腸多重癌症例もしくはポリープ多発例の遺伝子異常を解析　同一症例の大腸粘膜から発生する腫瘍の発育には同じパターンの遺伝子異常が関与している可能性が示唆される。よってそのメカニズムを解明するため大腸の腺腫、鋸歯状病変などが多発する症例の正常粘膜も含めた遺伝子異常を解析。特に多発ポリープや正常粘膜におけるLINE-1のメチル化レベルをPyrosequencing法を用いて解析する。またノンコーディングRNAの一つであるmicroRNAの発現に関してもアレイシステムを用いて網羅的に解析を行い、同一個人の腸管内でおこるそれらの異常を比較検討して大腸発癌の機序を解明する。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

大腸癌・大腸ポリープの臨床検体の集積は順調であり、パラフィン標本からDNAのみならずmicroRNA抽出にも成功している。それらを用いてKRAS（codon 61、146）、BRAF（V600E）、PIK3CA (exon 1、9、20) の遺伝子変異をパイロシークエンサーで検出するのにも成功しており大腸癌・大腸ポリープの遺伝子変異の解析を行うことが可能となっている。またそれらの遺伝子変異のみならずLINE-1メチル化レベルの解析も順調であり、5-FUや分子標的薬剤との感受性の検討も順調に進んでいる。同一症例の大腸癌、他部位に存在するポリープ、また正常粘膜からもDNAやmicroRNAを抽出するのにも成功しており、いくつかのDNAメチル化のマーカーが共通の遺伝子異常をきたしていることも明らかにしつつある。

今後の研究の推進方策

大腸癌の遺伝子変異やDNAメチル化の解析はほぼ終了しているため、次に抽出したmicroRNAをアレイシステムで網羅的にその遺伝子発現を解析する予定。その解析から診断・治療のバイオマーカーになりうるmicroRNAを同定する予定。症例の集積が可能であれば大腸癌以外の消化器癌でも同様の検討を行う予定。また消化器癌(食道癌, 胃癌, 胆管癌, 膵癌)の臨床検体を用いて, 特異的なT-cell リンパ球（CD3,　CD8, CD45RO, FOXP3等）の免疫染色を行い、大腸癌と同様にそれらが予後に相関するバイオマーカーとなりうるか解析を進める予定。

次年度の研究費の使用計画

消化器癌症例から抽出したmicroRNAをアレイシステムで網羅的にその遺伝子発現を解析するため、研究費からそれらのパラフィンブロック切り出しと抽出薬の費用を捻出。またアレイシステムのキットも購入する予定。これらの作業に携わる研究補助員の謝礼も研究費から支払う予定。特異的なT-cell リンパ球（CD3,　CD8, CD45RO, FOXP3等）の免疫染色に用いる抗体の購入を行う予定。

研究成果

• [雑誌論文] Upregulation of miR-196a and HOTAIR drive malignant character in gastrointestinal stromal tumors. (2012)
  • 著者名/発表者名: Niinuma T, Suzuki H, Nojima M, Nosho K, Yamamoto H, et al.
  • 雑誌名: Cancer Res. 巻: 72 ページ: 1126-36
  • 査読あり
• [雑誌論文] Insulin-like growth factor receptor expression is associated with aggressive phenotypes and has therapeutic activity in biliary tract cancers. (2012)
  • 著者名/発表者名: Ohashi H, Adachi Y, Yamamoto H, Taniguchi H, Nosho K, et al.
  • 雑誌名: Cancer Sci. 巻: 103 ページ: 252-61
  • 査読あり
• [雑誌論文] Prognostic Role of PIK3CA Mutation in Colorectal Cancer: Cohort Study and Literature Review. (2012)
  • 著者名/発表者名: Liao X, Morikawa T, Lochhead P, Imamura Y, Kuchiba A, Yamauchi M, Nosho K, et al.
  • 雑誌名: Clin Cancer Res. 巻: 18 ページ: 2257-68
  • 査読あり
• [雑誌論文] Association of CTNNB1 (beta-catenin) alterations, body mass index, and physical activity with survival in patients with colorectal cancer. (2011)
  • 著者名/発表者名: Morikawa T, Kuchiba A, Yamauchi M, Meyerhardt JA, Shima K, Nosho K, et al.
  • 雑誌名: JAMA 巻: 305 ページ: 1685-94
  • 査読あり
• [雑誌論文] Phosphorylated AKT expression is associated with PIK3CA mutation, low stage, and favorable outcome in 717 colorectal cancers. (2011)
  • 著者名/発表者名: Baba Y, Nosho K, Shima K, Hayashi M, Meyerhardt JA, et al.
  • 雑誌名: Cancer 巻: 117 ページ: 1399-408
  • 査読あり
• [雑誌論文] STAT3 expression, molecular features, inflammation patterns, and prognosis in a database of 724 colorectal cancers. (2011)
  • 著者名/発表者名: Morikawa T, Baba Y, Yamauchi M, Kuchiba A, Nosho K, et al.
  • 雑誌名: Clin Cancer Res. 巻: 17 ページ: 1452-62
  • 査読あり
• [雑誌論文] MGMT promoter methylation, loss of expression and prognosis in 855 colorectal cancers. (2011)
  • 著者名/発表者名: Shima K, Morikawa T, Baba Y, Nosho K, Suzuki M, et al.
  • 雑誌名: Cancer Causes Control. 巻: 22 ページ: 301-9
  • 査読あり
• [学会発表] 大規模前向きコホート研究を用いた大腸癌における腫瘍浸潤T細胞と分子生物学的異常・予後との関係
  • 著者名/発表者名: 能正勝彦、山本博幸、篠村恭久
  • 学会等名: 第98回日本消化器病学会総会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 平成24年4月19日
• [学会発表] 新たなphenotypeとしてのLINE-1 extreme hypomethylator phenotype (LEHP) の可能性
  • 著者名/発表者名: 能正勝彦、五十嵐央祥 、須河恭敬 、山本博幸、足立靖 、荻野周史 、篠村恭久
  • 学会等名: 第109回日本内科学会総会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 平成24年4月15日
• [学会発表] 大腸発癌におけるSerrated polyp pathwayの重要性とfield cancerization
  • 著者名/発表者名: 能正勝彦、山本博幸、篠村恭久
  • 学会等名: 第109回消化器病学会北海道支部例会(招待講演)
  • 発表場所: 札幌
  • 年月日: 平成23年9月11日
• [学会発表] 大腸癌におけるinsulin-like growth factor 2 (IGF2) DMRのmethylation levelの低下と生物学的悪性度との関係
  • 著者名/発表者名: 能正勝彦、馬場祥史、足立靖、篠村恭久
  • 学会等名: 第53回Japan Digestive Disease Week (JDDW)
  • 発表場所: 福岡
  • 年月日: 平成23年10月21日