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2012 年度 実施状況報告書

気道上皮細胞の分化誘導法の確立

研究課題

研究課題/領域番号 23790899
研究機関東京大学

研究代表者

齋藤 朗  東京大学, 保健・健康推進本部, 助教 (90591412)

キーワード国際情報交換
研究概要

前年度に引き続き、多能性幹細胞からの気道上皮細胞の分化誘導法の確立を目指し、培養条件の検討を行った。まずマウスES細胞株EB5を用いて実験を進めた。レトロウイルスによる遺伝子導入を試み、FACS解析により約30%の導入効率が得られたが、発現レベルは低かった。次に胚様体形成(hanging drop法あるいはペトリ皿上での浮遊培養 )あるいは平面培養によって分化を促し、さらにactivin刺激による内胚葉系細胞の誘導を試みた。さらに気道上皮用の培養条件も組み合わせた。過去の文献を参考にして、TGF-beta阻害剤(LY364947)・BMP阻害剤(dorsomorphin)・BMP4・FGF2刺激などを組み合わせて、培養条件の最適化を試みた。内胚葉系細胞および気道上皮細胞のマーカーとしてFOXA2およびTTF-1を指標としたが、コントロールとして用いたマウス気道上皮細胞MLE12と比較して、その発現レベルは低いレベルにとどまった。これらの結果より、将来的な応用を考えるとヒトiPS細胞を用いた実験にシフトする方が有望と判断した。まずはヒト皮膚線維芽細胞株NR1RGBからのiPS細胞の作出を試みた。addgeneよりiPS細胞誘導因子を組み込んだプラスミドを入手した(Oct3/4、L-Myc、Lin28、shp53、KLF4、SOX2)。エレクトロポレーションによる遺伝子導入の最適化を行い、形態的にiPSに類似した細胞コロニーの作出に成功した。さらにアルカリフォスファターゼ染色や、未分化マーカーの発現確認(SSEA4、TRA60、TRA81)、免疫不全マウスへの移植による奇形腫形成によって未分化性・多分化能を確認し、iPS細胞であると判断した。奇形腫の中に気道上皮と思われる繊毛上皮組織を確認した。現在はヒトiPS細胞からの気道上皮細胞の誘導を目指して条件検討を行っている。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

マウスES細胞株を用いた実験を繰り返し、期待通りの結果を得られなかった。
ヒトiPS細胞の遺伝子導入の条件検討に多くの労力を必要とした。

今後の研究の推進方策

ヒトiPS細胞からの気道上皮細胞の分化誘導の条件検討を行う。
iPS細胞および、分化誘導をさせた細胞への遺伝子導入手法が確立されつつあり、気道上皮細胞のマスター転写因子であるTTF-1を発現させる方法を検討している。

次年度の研究費の使用計画

ヒトiPS細胞、よび分化細胞の細胞培養に必要となる細胞培養関連備品、培養液、増殖因子の購入に充てる。

  • 研究成果

    (3件)

すべて 2013 2012

すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件) 学会発表 (1件)

  • [雑誌論文] An integrated expression profiling reveals target genes of TGF-β and TNF-α possibly mediated by microRNAs in lung cancer cells.2013

    • 著者名/発表者名
      Saito A, Suzuki HI, Horie M, Ohshima M, Morishita Y, Abiko Y, Nagase T.
    • 雑誌名

      PLoS One.

      巻: 8(2) ページ: e56587

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0056587.

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Characterization of human lung cancer-associated fibroblasts in three-dimensional in vitro co-culture model.2012

    • 著者名/発表者名
      Horie M, Saito A, Mikami Y, Ohshima M, Morishita Y, Nakajima J, Kohyama T, Nagase T.
    • 雑誌名

      Biochem Biophys Res Commun.

      巻: 423(1) ページ: 158-163

    • DOI

      10.1016/j.bbrc.2012.05.104.

    • 査読あり
  • [学会発表] An integrated expression profiling reveals target genes of TGF-β and TNF-αpossibly mediated by microRNAs in lung cancer cells2012

    • 著者名/発表者名
      齋藤朗
    • 学会等名
      2012 International Tumor Microenvironment Conference
    • 発表場所
      Suzhou Dushu Lake Conference Center(中国・蘇州市)
    • 年月日
      20121113-20121117

URL: 

公開日: 2014-07-24  

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