| 研究概要 |
平成23年度はALSモデルマウスであるG93A変異SOD1トランスジェニックマウスを用い、発症前から発症後期までの各ステージでTRIADにおいて重要なp73、リン酸化p73、FL-YAP、YAPdeltaCについての免疫染色、Westerm-blotを行った。またYAP遺伝子発現状況をリアルタイムRT-PCRで定量的に検討した。具体的にはマウス脊髄から前半部分を分離採取し、TNE buffer [10 mM Tris-HCl (pH 7.8), 1% NP-40, glycerol, 0.15M NaCl, 1 mMEDTA, 10 μg/mL aprotinin, 1 mM PMSF, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF]を加え、氷冷しつつ超音波破砕後、12000×gで遠心分離し、上層液抽出しSDS-PAGEで泳動分離、Westen-blotに使用した。Western-blotでは抗p73、抗リン酸化p73抗体、抗FL-YAP、抗YAPdeltaC抗体によりβ-tubulinとの比を求め組織発現量を半定量した。RT-PCR TRIzol reagent (Invitrogen, CA)内でTg、WTの脊髄組織をホモジナイズし抽出したRNAでリアルタイムRT-PCRを行った。運動ニューロンのカウント 染色陽性運動ニューロンの比率を評価計算するためにL4腰髄の運動ニューロン残存数をカウントした。
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