研究課題
糖尿病状態では膵β細胞内のチロシンキナーゼSrcが活性化していることにより酸化ストレスが増加し、インスリン分泌が減少していることを申請者らは明らかにしてきた。また、cAMPを増加させるGPCRリガンドは糖尿病状態でのSrc活性化を抑制し酸化ストレスを軽減する新たな作用を持つことを近年明らかにした。しかしながら詳細なメカニズムは不明である。本研究の目的は、糖尿病β細胞におけるSrcの役割について解明すること、GPCRシグナルのSrc制御機構を解明し新たなインスリン分泌増強作用により糖尿病治療法を見出すことである。まず、Srcのインスリン分泌機構への関与およびメカニズムについて検討するために、Srcを多く発現しているインスリノーマ由来の細胞株INS-1細胞にSrc-SiRNAを導入し発現を低下させると、ブドウ糖によるインスリン分泌は減少した。また、ミトコンドリア基質となるピルビン酸によるインスリン分泌に対しても減少効果を示した。ブドウ糖によるATP産生はSrc-SiRNAにより有意に減少し、ピルビン酸によるATP産生も同様に減少した。ミトコンドリアの呼吸鎖に関与する各タンパクの発現自体はSrcのノックダウンにより影響を認めなかった。一方で、解糖系の指標となるglucose utilizationを測定したところ、Srcノックダウンにより解糖系の減弱が認められた。さらに、GPCRリガンドによるインスリン分泌増強もSrcノックダウンにより減少を示した。以上の結果より、膵β細胞インスリン分泌機構にSrcが関与していること、それはミトコンドリアだけではなくその上流の解糖系にもSrcが何らかの影響を及ぼしていることが明らかとなった。このことは、Srcの膵β細胞における役割の一部を明らかにできただけではなく、Srcのインスリン分泌機構における重要性が示される結果となった。
2: おおむね順調に進展している
本研究の目的は、糖尿病β細胞におけるSrcの役割について解明すること、GPCRシグナルのSrc制御機構を解明し新たなインスリン分泌増強作用を示すことにより、糖尿病治療法を見出すことであるであるが、今回の研究結果では、Srcの膵β細胞における役割について、インスリン分泌および分泌機構に重要なATP産生、解糖系について評価することができた。また機能だけではなくミトコンドリアタンパクの発現調節に関しても検討した。結果として、Srcがミトコンドリアタンパク発現には影響を及ぼさず、インスリン分泌機構の機能に大きく関与していることが明らかとなり、β細胞におけるSrcの重要性が確認できた。特に、ATP産生の場であるミトコンドリア部分だけでなく、予想に反してそれより上流の解糖系においてもSrcが関与していることが今回の結果で明らかとなった。このことは、Srcのインスリン分泌における役割が多岐にわたっている可能性を示しており、Srcの役割の解明を進めていくことにより、インスリン分泌におけるSrcの意義や糖尿病における動態を示すことができると確信する。またGPCRリガンドによるインスリン分泌増強に対するSrcの制御については、インスリン分泌実験結果からSrcの関与が明らかとなり、今後ブドウ糖によるインスリン分泌とは別の角度から検討を進める予定である。
インスリン分泌機構におけるSrcの役割について、シグナル伝達関連分子を同定するために、Srcに直接結合している分子群を免疫沈降法をはじめとするさまざまな手法を用いて単離し、それが既知の分子か未知の新たな分子であるのかを、複数見つかった場合は個々に検討し、それぞれの活性制御機構について明らかにする。さらに、同定されたSrc関連分子群の機能や活性状態、制御シグナル機構について、正常な状態と糖尿病での状態（代謝障害下、酸化ストレス亢進下など）とでどのような違いが生じているのかを明らかにし、糖尿病におけるβ細胞機能破綻機構について明らかにする。また、GPCRとSrc間のシグナル伝達を明らかにする目的で、GPCRに直接Srcが結合していることが他の細胞で報告されていることから、β細胞におけるGPCRから直接Srcを介する経路が存在している可能性を検討する。並行してSrcがβ細胞の細胞質だけでなくミトコンドリアにも存在するかどうか、およびミトコンドリア機能に対して影響を及ぼすかどうかを検討する。存在が確認できた場合、β細胞ミトコンドリアにアデニリルシクラーゼやcAMPシグナルに関連する他の分子の存在の有無を確認し、それらがβ細胞ミトコンドリアでのATP産生に影響を及ぼしているのかどうかを検討し、SrcのATP産生制御機構を明らかにする。さらに、糖尿病状態においてどのように変化しているかどうか、数種の糖尿病モデル動物を用いて比較検討し、糖尿病状態での障害・異常メカニズムを明らかにする。
申請者はβ細胞の研究を長年行ってきており、さまざまな測定技術を開発・習得済みである。したがって、この研究を遂行するにあたり必要な技術や実験手法、それに伴う機械設備はすでに整っている。したがって、次年度の研究費は各実験手法における試薬類や実験器具類等、物品類の購入に主に使用する。
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