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2011 年度 実施状況報告書

疾患iPS細胞を用いたヒトTPO/c-MPLの造血幹細胞制御機構の解明

研究課題

研究課題/領域番号 23791154
研究機関京都大学

研究代表者

高山 直也  京都大学, iPS細胞研究所, 助教 (10584229)

研究期間 (年度) 2011-04-28 – 2013-03-31
キーワード疾患特異的iPS細胞 / 造血不全
研究概要

疾患特異的iPS細胞は、発症の機序の解明、創薬開発につなげることが期待されている。申請者らは、造血幹細胞増幅因子であるトロンボポイエチン(TPO)受容体c-MPLの遺伝子異常疾患(CAMT;Congenital Amegakaryocytic Thrombocytopenia)患者からiPS細胞を樹立した。正常c-MPLの発現制御を付加する系によりin vitroでの分化実験及び、in vivoの特殊環境下に生着したHSCを用いて、ヒトTPO/c-MPLシグナルが造血幹・前駆細胞の発生及び自己複製・分化制御機構にどのように関与するのかを検証した。その結果、in vitroの血液分化法を用いて、本年度は以下の点を明らかにした。(1)CD34陽性造血前駆細胞の発生効率には正常MPLの発現は明らかな効果はない。(2)CD34陽性造血前駆細胞においては、その細胞の維持、および増殖能にMPL signalが重要な役割を果たしている。(3)MPL欠損によりCD34陽性造血前駆細胞から、各種骨髄球系細胞への分化は障害されるが、巨核球/赤芽球共通前駆細胞段階での障害が顕著であり、この2系統への分化には必須である。(4)レトロウイルスベクターによるWild type MPLの強制発現により遺伝子を修復したCAMT-iPS細胞では、これら分化能の障害は一部改善された。しかし、巨核球分化において、巨核球の成熟マーカーの一つであるフォンウィルファクターレセプター(GPIX、GPIbなど)の発現が低い成熟が止まった巨核球が一部産生されることを見いだした。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本申請では、1)一定濃度のTPO存在下でc-MPLの発現量を調節することで、in vitroで顆粒球、赤芽球、巨核球に分化発生に必須であるc-MPLの閾値を定量的に評価する。2)in vivoでc-MPL発現を制御し、奇形腫法で作成したヒト造血幹細胞を用いてMPL欠損により生じる造血幹細胞枯渇機序を解明する。3)遺伝子修復による遺伝子治療モデルを提示する、ことを目的とした。MPL発現を調節できるDD-systemを用いる予定であったが、Shield-1での発現が制御できなかったため、レトロウイルスベクターによる強制発現系を用いた。1)のin vitroでの分化実験において、CAMT-iPS細胞、c-MPL修復CAMT-iPS細胞、コントロールの正常皮膚iPS細胞の3群を比較した。CD34陽性細胞を用いてコロニーアッセイを行うと、CAMT-iPS由来CD34細胞では、すべての骨髄球系細胞でコロニー数の減少が確認できた。さらにCD34陽性分画の細胞はin vitroにおいて維持されず、CD34陽性造血前駆細胞の増殖・維持に重要であることを明らかにした。さらにCD34陽性細胞から、赤血球/巨核球の共通前駆細胞である、CD41a/GlycophorinA共陽性細胞集団への分化課程で著しく障害されていることが明らかになった。3)の遺伝子修復モデルの検討では、レトロウイルスベクターを用いたMPL遺伝子修復により、これらの障害が改善することが確認された。しかし、過剰なMPLにより、異常な巨核球の産生が観察された。以上からin vitroの実験系において、CD34陽性造血前駆細胞およびさらに分化した巨核球/赤血球前駆細胞段階でのMPL signalの役割を明示でき、さらにレトロウイルスを用いた遺伝子修復法の問題点も見いだしているため、比較的順調に進行していると考えている。

今後の研究の推進方策

遺伝子修復法に関しては、レトロウイルスベクターを用いた強制発現系では、in vitroの分化実験において、50%程度の巨核球がCD41a陽性/GPIX陰性/GPIb陰性の段階で成熟が止まってしまうことを見いだしている。本年度は、そのシグナル強度と巨核球成熟阻害についての影響を遺伝子発現アレイ、定量PCR法で解析する予定である。さらに適正な遺伝子修復法を確立するために、Homologous recombinationを含むベクターシステムの再構築を検討する。ヒト細胞は一般的に相同組み換えの効率が非常に低いことが知られているため、Zinc finger nucleaseによる遺伝子組み換えを予定している。さらに本年度はテラトーマ法により、CAMT-iPS細胞及び遺伝子修復後のCAMT-iPS細胞からの造血幹細胞誘導を試み、生体内での造血幹細胞でのMPL signalの寄与について検討する予定である。

次年度の研究費の使用計画

テラトーマ法に用いる免疫不全(NOG)マウス代(15000円/匹)に使用する。in vitroの培養系においては、Homologous recombination法による完全修復型のCAMT-iPS細胞樹立を目指す。Zinc finger法を用いた場合でも、遺伝子修復クローンが得られる可能性は、1%以下であると考えられるため、一過性ではあるが、1000個以上のiPSコロニーの維持が必要となる。また、作成された完全修復型のiPS細胞を用いて分化実験を行うため、比較的大量のサイトカイン(basic FGF, VEGF, SCF, TPO)と培養試薬、細胞解析のための染色抗体が必要である。

  • 研究成果

    (19件)

すべて 2012 2011 その他

すべて 雑誌論文 (8件) (うち査読あり 5件) 学会発表 (10件) 産業財産権 (1件)

  • [雑誌論文] PKA/CREB Signaling Triggers Initiation of Endothelial and Hematopoietic Cell Differentiation via Etv2 Induction.2012

    • 著者名/発表者名
      Yamamizu K, Matsunaga T, Katayama S, Kataoka H, Takayama N, Eto K, Nishikawa S, Yamashita JK.
    • 雑誌名

      Stem cells

      巻: 30 ページ: 687-696

    • 査読あり
  • [雑誌論文] In vitro generation of megakaryocytes and platelets from human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells.2012

    • 著者名/発表者名
      Takayama N, Eto K.
    • 雑誌名

      Methods Mol Biol.

      巻: 788 ページ: 205-17

    • 査読あり
  • [雑誌論文] In vivo imaging visualizes discoid platelet aggregations without endothelium disruption and implicates contribution of inflammatory cytokine and integrin signaling.2012

    • 著者名/発表者名
      Nishimura S, Manabe I,Takayama N, Eto K, Nagai R. et al.
    • 雑誌名

      Blood

      巻: 119 ページ: e45-56

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Heterozygous ITGA2B R995W mutation inducing constitutive activation of the {alpha}IIb{beta}3 receptor affects proplatelet formation and causes congenital macrothrombocytopenia.2011

    • 著者名/発表者名
      Kunishima S, Kashiwagi H, Otsu M, Takayama N, Eto K, Onodera M, Miyajima Y, Takamatsu Y, Suzumiya J, Matsubara K, Tomiyama Y, Saito H.
    • 雑誌名

      Blood

      巻: 117 ページ: 5479-5484

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Constitutive STAT5A activation enables erythropoiesis from human embryonic stem cell-derived primitive hematopoietic cells in the absence of erythropoietin.2011

    • 著者名/発表者名
      Shimizu T., Sano S., Takayama N., Kaneko S., Eto K., Takeuchi Y., and Nakauchi H.
    • 雑誌名

      Kitasato Medical Journal

      巻: 41 ページ: 42-49

    • 査読あり
  • [雑誌論文] 「ヒトiPS細胞を用いた血小板再生」2011

    • 著者名/発表者名
      高山直也、江藤浩之、中内啓光
    • 雑誌名

      日本臨床

      巻: 69 ページ: 2161-2165

  • [雑誌論文] 「ヒト多能性幹細胞を用いた巨核球/血小板造血研究」2011

    • 著者名/発表者名
      高山直也、江藤浩之
    • 雑誌名

      医学のあゆみ

      巻: 239 ページ: P1385-3431390

  • [雑誌論文] 「ヒトiPS細胞からの止血効果を持つ血小板の生成」2011

    • 著者名/発表者名
      高山直也、江藤浩之
    • 雑誌名

      血液内科

      巻: 63 ページ: 339-343

  • [学会発表] Human induced pluripotent stem cell-derived blood cells toward clinical application2011

    • 著者名/発表者名
      Takayama N.
    • 学会等名
      17th International Symposium on Gnotobiology and 34th Congress of the Society for Microbial Ecology and Disease.(招待講演)
    • 発表場所
      Yokohama, Japan
    • 年月日
      Nov 20-23, 2011
  • [学会発表] Suspected incomplete reprogramming in blood-derived human induced pluripotent stem cells is advantageous for adult-type erythrocyte generation with globin switching2011

    • 著者名/発表者名
      Takayama N, Sano S, Shimizu T., Kawahata R., Endo H., Nakamura S., Ogawa S., Nakauchi H., and Eto K.
    • 学会等名
      International Society for Stem Cell Research 9th Annual Meeting (ISSCR)
    • 発表場所
      Toronto, Canada
    • 年月日
      June 15-18, 2011
  • [学会発表] TRANSIENT ACTIVATION OF C-MYC EXPRESSION IS CRITICAL FOR EFFICIENT PLATELET GENERATION FROM HUMAN INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS2011

    • 著者名/発表者名
      Takayama N, Nishimura S, Nakamura S, Shimizu T, Ohnishi R, Endo H, Yamaguchi T, Otsu M, Nishimura K, Nakanishi M, Sawaguchi A, Nagai R, Takahashi K, Yamanaka S, Nakauchi H, Eto K.
    • 学会等名
      XXIII Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis
    • 発表場所
      Kyoto, Japan
    • 年月日
      July 23-28, 2011
  • [学会発表] 輸血医療革命をもたらす多能性幹細胞由来不死化巨核球細胞株樹立技術の開発

    • 著者名/発表者名
      中村壮、高山直也、中内啓光、江藤浩之
    • 学会等名
      第32回日本炎症・再生医学会
    • 発表場所
      京都
    • 年月日
      平成23年6月2-3日
  • [学会発表] Platelet transfusion system using an immortalized megakaryocyte cell line derived from hESCs/iPSCs

    • 著者名/発表者名
      Sou Nakamura, Naoya Takayama, Hiromitsu Nakauchi, Koji Eto
    • 学会等名
      第73回日本血液学会学術集会
    • 発表場所
      名古屋
    • 年月日
      平成23年10月14-16日
  • [学会発表] Platelet Production System Using an Immortalized Megakaryocyte Cell Line Derived From Human Pluripotent Stem Cells

    • 著者名/発表者名
      Nakamura S., Takayama N.(発表者),, Nakauchi H., and Eto K.
    • 学会等名
      53rd ASH Annual Meeting and Exposition
    • 発表場所
      San Diego, USA
    • 年月日
      December 10 - 13, 2011.
  • [学会発表] Modeling Congenital Amegakaryocytic Thrombocytopenia Using Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells

    • 著者名/発表者名
      Naoya Takayama, Shinji Hirata, Ryoko Jono-Ohnishi, Eiichi Ishii, Hiromitsu Nakauchi, Shinji Kunishima, and Koji Eto et.al
    • 学会等名
      53rd ASH Annual Meeting and Exposition.
    • 発表場所
      San Diego, USA
    • 年月日
      December 10 - 13, 2011.
  • [学会発表] Stepwise Signaling and Low Oxygen Promote Hematopoietic Progenitor Emergence From Human Pluripotent Stem Cells

    • 著者名/発表者名
      Hiroshi Endo, Naoya Takayama, Tomo Koike, Hiromitsu Nakauchi, and Koji Eto
    • 学会等名
      53rd ASH Annual Meeting and Exposition.
    • 発表場所
      San Diego, USA
    • 年月日
      December 10 - 13, 2011.
  • [学会発表] Continuous Inhibition of ADAM17 Using a Novel Selective Inhibitor Restores Functional Platelet Yield From Human Pluripotent Stem Cells

    • 著者名/発表者名
      Shinji Hirata, Ryoko Jono-Ohnishi, Satoshi Nishimura, Naoya Takayama, Sou Nakamura, Hiromitsu Nakauchi, Takahiko Murata, and Koji Eto
    • 学会等名
      53rd ASH Annual Meeting and Exposition.
    • 発表場所
      San Diego, USA
    • 年月日
      December 10 - 13, 2011.
  • [学会発表] In Vitro Generation of Mature T Lymphocytes From Human Ips Cells and Genetic Analysis of TCR Gene Rearrangements

    • 著者名/発表者名
      Toshinobu Nishimura, Shin Kaneko, Yoko Tajima, Naoya Takayama, Ai Tachikawa-Kawana, Koji Eto, and Hiromitsu Nakauchi.
    • 学会等名
      53rd ASH Annual Meeting and Exposition.
    • 発表場所
      San Diego, USA
    • 年月日
      December 10 - 13, 2011.
  • [産業財産権] 血小板産生の場構築の為の巨核球細胞の多核化の促進法2011

    • 発明者名
      江藤浩之、中内啓光、高山直也、中村壮
    • 権利者名
      江藤浩之、中内啓光、高山直也、中村壮
    • 産業財産権番号
      特許: 特願2011-108253
    • 出願年月日
      2011年05月13日

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公開日: 2013-07-10  

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