疱疹状天疱瘡・増殖性天疱瘡における抗デスモコリン自己抗体の関与の研究

2011 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 23791301
• 研究機関: 久留米大学
• 研究代表者: 石井 文人 久留米大学, 医学部, 講師 (80330827)
• 研究期間 (年度): 2011-04-28 – 2013-03-31
• キーワード: 皮膚診断学 / 皮膚免疫学 / 自己免疫性水疱症 / 疱疹状天疱瘡 / 増殖性天疱瘡 / デスモコリン / ELISA法

研究概要

疱疹状天疱瘡・増殖性天疱瘡は古典型天疱瘡の亜型として分類される。古典型天疱瘡と同様にIgG クラスの表皮細胞膜表面に対する自己抗体が検出されるが、その臨床像は特異的である。本研究では、疱疹状・増殖性天疱瘡におけるデスモコリン(Dsc)蛋白に対するIgG自己抗体の検出とその病原性を検討することにより、疱疹状天疱瘡・増殖性天疱瘡における病変発症機序を解明することを目的とする。平成23年度は現在までに本施設で保存している疱疹状・増殖性天疱瘡の患者血清と古典型天疱瘡症例に対し、蛍光抗体法、ELISA法、表皮抽出液を基質とした免疫ブロット法やcDNA-トランスフェクション法（デスモコリン（Dsc）のcDNAを用いた有核細胞トランスフェクション法）を用いて、各症例のデスモグレインを含めたデスモコリンに対する自己抗原の検索を行った。Dsc-ELISA法では、ヒトDsc1,Dsc2,Dsc3の細胞外領域全長の組み換え蛋白質をバキュロウイルス発現系を用いて作製し,その組み換えDsc蛋白質を基質としたELISAを施行した。またcDNA-トランスフェクション法による3種のヒトDscの全長をコードするcDNAをCOS7細胞に遺伝子導入し、Dscを発現させ、それを用いたliving cell蛍光抗体間接法を行った。上記手法を用いて、古典型と臨床像を画す亜型（疱疹状・増殖性）天疱瘡に抗Dsc IgG抗体を検出する症例を多く検出した。その他にデスモグレインに対する自己抗原の解析も行った。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

申請時に予定していた疱疹状・増殖性天疱瘡の患者血清と、対象となる古典型天疱瘡患者血清を収集し、蛍光抗体法、ELISA法、表皮抽出液を基質とした免疫ブロット法およびcDNA-トランスフェクション法を用いて、各症例および疾患のデスモグレインを含めたデスモコリンに対する検出される自己抗原の特徴づけを行った。これまでのところ、昨年に提出した交付申請書のタイムテーブルとやや遅れている進行である（申請時に平成23年度に予定していたcryosection法の研究が今年度施行できていない）。これは多くの症例に対する抗原抗体解析にて、各種検査法における有用性の慎重に検討を行い進行している結果であり、今後はcryosection法を含めたデスモコリン蛋白に自己抗原の存在がpathogenicなものか、未だ示されていない点に着目し、研究を推進していく予定である。

今後の研究の推進方策

平成23年度は抗Dsc抗体を有する亜型天疱瘡血清を抽出した。平成24年度はデスモコリン蛋白に自己抗原に対する病原性を評価することに目的を置き、下記研究を行い、総合的評価を行う予定である。自己免疫の直接証明として、以下の順また並行して、研究に取り組むことを計画する。(1)cryosection法によるex vivoの系から研究に取り組む予定である。凍結切片法による正常皮膚に抗デスモコリン抗体のみ陽性の疱疹状または増殖性天疱瘡患者血清を24時間インキュベートさせ、表皮細胞間の離解と生体外水疱形成の有無をみて抗Dsc IgG自己抗体を検出する患者由来IgGの水疱形成能を評価する。(2)動物モデルの作製として、疱疹状・増殖性天疱瘡患者血清から精製したIgGをマウスに投与し,病変の再現しうるかどうか検討を行う。さらに前述した動物モデル以外での手法におけるモデルマウス作製を試みる。また平成23年度に施行した抗原抗体解析の結果を総合的に患者背景および臨床学的特徴の検討を行う予定である。

次年度の研究費の使用計画

一般実験試薬、一般実験器具、各種抗体、各種酵素、タンパク質精製試薬・装置、細胞培養液、牛血清アルブミン等に費用がかかる。研究経費のすべては研究に要する実験試薬・実験器具、そのほかの消耗品が占める。研究の速やかな遂行を図るため必要最低限の設備備品の購入を予定している。平成24年度では、一般実験試薬（各種抗体,核酸,酵素,培地等）に300千円、ガラス,プラスチック器具類に200千円、一般実験器具（樹脂製消耗品含む）に300千円、実験動物（家兎,マウス購入）に600千円を予定している。