| 研究概要 |
本研究課題は癌抑制遺伝子BRCA1及びBAP1がDNA損傷応答時にどのように関与するのか明らかにし、DNA損傷時にユビキチン化と脱ユビキチン化が担う役割を解明する物である。BRCA1の主な動きとしてはDNA損傷が起こると細胞周期のS,G2期にて騒動組換え修復で働いている事が解明されている。この事から、BRCA1とBARD1がBAP1と共にDNAの相同組換え修復で機能している事が予測される。研究計画に従って平成23年度にはBAP1の基質の同定を行い培養細胞を用いた一過性過剰発現の系にて質量分析を行い候補タンパク質を複数同定した。
本年度は、同定された複数の候補タンパク質を研究計画に従ってDNA相同組換え修復時のBAP1による脱ユビキチン化の基質としての役割を検討した。
当初計画では、siRNA,shRNAを用いた安定発現細胞を作成する予定であったがBAP1の発現を低下させると細胞自身の安定性が失われ、研究を進める上で扱いが難しい事が判明した為、BAP1と基質候補タンパク質の結合を阻害する方法を検討した。BAP1のフラグメントタンパク質と基質タンパク質をSPR解析にて結合部位の同定を行い結合が観察された領域内のミスセンス変異をNCBIのデータベースを参考にしてプラスミドベクターを作成した。
作成した数種類のBAP1発現ベクターと基質タンパク質の発現ベクターを細胞に一過性発現させ、免疫沈降後にウエスタンブロット法にて結合の有無を確認した。この実験によって結合の外れる変異部位を確立した。
当初計画に戻り、siRNAとミスセンス変異安定発現細胞株の組み合わせを行って内在BAP1を低下させ目的基質と結合できない変異型BAP1を発現させる細胞株を用いて、コメットアッセイ、DNA障害感受性試験、免疫染色を現在行っているところである。
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