| 研究概要 |
本研究課題では癌抑制遺伝子BRCA1及びBAP1がDNA損傷応答時にどのように関与するのか明らかにし、DNA損傷時にユビキチン化と脱ユビキチン化が担う役割を解明する。BRCA1の主な働きとしてはDNA損傷（DNAの2本鎖切断）が起こると細胞周期のS, G2期にて相同組替え(homologous recombination: HR)修復で働いていることが解明されている。このことから、BRCA1/BARD1とBAP1がDNAの相同組換えで機能していることが予測される。
平成23年度、BAP１の基質（脱ユビキチン化する相手）の同定。IP-LC-MS/MSにて網羅的にBAP1結合タンパクの解析を行った。免疫沈降-液体クロマトグラフィ-タンデムマススペクトロメトリー (IP-LC-MS/MS)法を用いて実験を行った。質量データをMATRIX Science社のMASCOT及びX!Tandemの２つのプログラムを用いてデータベース検索を行い結合タンパクを同定した。
平成24年度、DNA相同組換え修復時の役割を解明。DNA障害時のコメットアッセイ、感受性試験、蛍光免疫染色にてBAP1の役割を検討した。培養細胞にて内在性BAP1を減少又は消失させた状態でDNA障害を起こしコメットアッセイにてDNA切断を修復するのか検討した。BAP1-Null細胞を用いて内在性BAP1の減少又は消失条件を作成しIR、抗癌剤でDNA障害を作成する。BAP1による脱ユビキチン化がDNA修復に直接作用するか検討した。培養細胞を用いてコメットアッセイと同様にBAP1減少又は消失条件下でのDNA障害後の細胞生存率を測定した。培養細胞を用い、同一条件下で蛍光免疫染色し共焦点レーザー顕微鏡にて観察を行った。γH2AX,BRCA1,PolyUbiquitin,Rad51などのDNA障害に応答のあるタンパク質を染色してDNA損傷部位での集合を観察した。
平成25年度、DNA修復以外の役割を検討。フローサイトメトリー、ルシフェラーゼアッセイにてセルサイクル（チェックポイント）やDNA修復タンパク質の転写に関わるか検討した。
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