| 研究課題/領域番号 |
23791511
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| 研究機関 | 独立行政法人国立成育医療研究センター |
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研究代表者 |
渡邉 稔彦 独立行政法人国立成育医療研究センター, その他部局等, その他 (50306734)
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| 研究期間 (年度) |
2011-04-28 – 2013-03-31
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| キーワード | 臓器移植 / 臓器保存 / 心移植 / 脳死移植 / 磁場環境下凍結 / 過冷却凍結 / マウス |
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| 研究概要 |
（平成２３年度）～磁場環境下による臓器障害の組織学的検討（単純臓器保存）～１．実験モデル：Balb/cマウスを用い、24 時間の絶食の後にイソフルレン麻酔下で、心臓を、移植臓器摘出の手順に従って摘出し、冷ヘパリン加乳酸リンゲル液にて灌流した後、ＨＴＫ保存液、通常凍結、磁場環境下凍結の３群に分けて一定時間保存した。２．実験群(1) ＨＴＫ保存液：各臓器をＨＴＫ保存液に単純浸漬して、-4℃で保存する。(2) 通常凍結：冷ヘパリン加乳酸リンゲル液に浸漬して、-80 度の超低温冷蔵庫で保存する。(3) 磁場環境下凍結保存：冷ヘパリン加乳酸リンゲル液に浸漬して、磁場強度を0.1mT、1mT、10mT の3レベルで設定し-30℃で保存する。３．結果(1) 磁場環境下凍結保存の温度変化：1mT、10mTでは3分で-30℃へと速やかに達したが、0.1mTでは-30℃まで30分を要した。(2)組織学的障害の検討：通常凍結群では、心筋組織中に空隙が形成されていた。大動脈・肺動脈には内膜剥離が認められた。磁場環境下保存では心筋の組織構造は保たれており、脈管系にも異常所見を認めなかった。HTK保存液では心筋組織の融解壊死が認められたが、脈管系の組織は保たれていた。(3)保存液中の生化学的マーカーの分析：各群の保存液に含まれる保存臓器より漏出した生化学的マーカー（CK-MB、AST、LDH)は分析中
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究は、平成23年度は保存法によるグラフト組織障害の評価、平成24年度は保存法による臓器移植後のグラフト機能評価の2部構成となっている。各保存法のグラフト組織障害の評価別に、実際に生体へ移植した場合のグラフト機能評価が重要と考え、心臓のほか、肝臓・小腸・腎臓・肺でも保存後の評価を行うこととしていたが、最も移植手技が簡便であるマウス心臓移植に絞ることとした。臨床業務との兼任であるため、時間的な制限があるが、実際の移植手術以外のvitro分析については、研究員による研究協力を得て、分析を進めていくこととする。
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| 今後の研究の推進方策 |
心臓グラフトにおける組織障害の程度をスコアリングし、各保存法間で統計学的解析を行う。保存液の生化学的分析については、研究員の協力を得て、分析を進める。さらに複数回の磁場凍結を施行し、各磁場強度で保存したグラフトに組織学的に差があるが検討する。申請者が術者として、各保存法を経た心臓グラフトを、同種同系のマウスに移植し、各項目を検討する。検討は協力研究員のもとで速やかに施行していく。０．定期的に心電図、CTなどの生体での機能的検査を行う。1. 組織学的検討：ＨＥ染色を行い、虚血再灌流障害の程度をスケール分類する。2. Myeloperoxidase(MPO)活性：臓器への好中球浸潤の指標として、ＭＰＯ活性の定量化を行う。3. サイトカイン産生：RT-PCR 法により、炎症性サイトカイン（ＩＬ-１β、ＴＮＦ-α）、Th1 サイトカイン（ＩＦＮ-γ、IL-2）、およびTh2 サイトカイン(IL-4、ＩＬ-６、IL-13) の定量を行う。4. タンパク発現定量：Western Blot法により、caspase-3、NF-κB、Bcl-2、Bcl-xl、βactin を測定する。5. アポトーシス：Tunnel 染色を行い高倍率像（ｘ４００）でのTunnel 陽性細胞のカウントを行う。6. 血清中生化学的マーカー：血清中ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＬＤＨ、ＣＰＫの定量を行う。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
今年度は、保存臓器移植の実験が中心となり、マウス代、手術消耗品、麻酔薬、各種分析や染色の費用が中心となる。引き続き学会へも積極的に参加し、情報収集に努めるとともに、タブレット端末を購入して実験の進捗状況を常に持参し、関連研究の研究者にも結果などについて議論ができるようにする。
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