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本研究では硬さ制御可能な３次元培養用人工細胞外マトリックスを開発し、幹細胞の軟骨細胞への分化における３次元足場の硬さの影響を明らかにする。近年、細胞分化とその足場の硬さの関係が明らかにされたが、いずれも２次元培養での研究成果である。従来、硬さ制御には細胞毒性がある架橋剤を用いるために、３次元での培養はできなかったが、コラーゲンと化学的に等価であるゼラチンの融点を高める新技術を開発して３次元培養を実現し、濃度により硬さを制御するため、細胞へのダメージを最小化した培養環境を提供する。この３次元環境を利用して３次元の硬さが幹細胞の軟骨細胞分化に与える影響を解明する。
まず、培養環境(３７℃)で融解しない高融点ゼラチンを合成し、細胞の３次元包埋培養を実現する。ゼラチンの高融点化は（１）原料にアテロコラーゲンを用い、（２）低分子量化を抑制するゼラチン作成法ならびに（３）濃縮技術を確立した。作製したゼラチンを非分解性ゼラチン（ＵＣＧ）とし、濃度５％ＵＣＧは融点が約３７℃、ゲル化温度は約２４℃であった。しかしながら、ＵＣＧは３０℃に静置すると従来のゼラチンでは起こり得ない線維化がすることを発見した。これは３０℃でらせん構造の回復率が高いことに起因することが分かった。
次にゼラチン濃度で硬さを制御して３次元包埋培養の実験系を構築した。３０℃で５時間線維化させたＵＣＧゲルは濃度８％で弾性率が約５ｋＰaとなり、従来の市販コラーゲンゲル０．５％の約０．４ｋＰａと比べて硬いゲルが作製できた。いずれの濃度のＵＣＧにおいても細胞生存率は３日間で低下しなかった。しかしながら、ＵＣＧゲルは培養液を交換すると、その弾性率は著しく低下して長期培養に耐えられないことが判明した。分化に長期間を要するために安定性の高いＵＣＧゲルの作製方法を検討して成功したが、硬さが与える分化への影響の詳細な検討に至らなかった。
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