2011 年度実施状況報告書

加齢黄斑変性におけるミュークリスタリンの病態解析

研究課題

研究課題/領域番号	23791973
研究機関	信州大学
研究代表者	今井弘毅信州大学, 医学部, 助教 (50568409)
研究期間 (年度)	2011-04-28 – 2014-03-31
キーワード	ミュークリスタリン / レーザー誘発脈絡膜新生血管
研究概要	8-12週齢のオスのマウス（C57BL/6J）の片眼の眼底（視神経乳頭周囲の網脈絡膜）に半導体レーザー(810 nm; Oculight SLx; Iris Medical Instruments, Mountain View, CA) を用いてレーザー照射(照射条件125 μm spot size, 130 mW intensity, 50 ms duration：当初は75 μm spot size, 130 mW intensity, 100 ms durationの予定であったが、さまざまな条件を施行して予定を変更した) を行った。1週間後に尾静脈よりフルオレセイン染色を静脈注射したあと、蛍光眼底造影検査を行い、脈絡膜新生血管からの漏出による過螢光を確認した。2週間後に安楽死させた後、眼球摘出を行い、4％パラホルムアルデヒドによる灌流固定後、パラフィン包埋、ヘマトキシリン・エオジン染色を行った。光学顕微鏡にて組織学的に脈絡膜新生血管を確認し、マウスによるレーザー誘発脈絡膜新生血管モデルを確立することができた。同様にマウスレーザー誘発脈絡膜新生血管モデルを作成し、眼球摘出後に網膜を取り除き網膜色素上皮・脈絡膜・強膜を伸展させた。4％パラホルムアルデヒドで1時間固定して脈絡膜新生血管の血管内皮細胞に対する抗体である抗isolectin抗体による免疫組織化学染色を行い、染色された脈絡膜新生血管板を共焦点レーザー顕微鏡装置（TCS SP2; Leica ）で1μm厚ごとスキャンニングし、体積（当初は面積を予定していたが変更した）を測定することまで確立できた。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由当初の計画（レーザー誘発脈絡膜新生血管モデルの確立、免疫染色した脈絡膜新生血管板の共焦点レーザー顕微鏡装置による体積の測定）は達成できたため、おおむね順調に進展していると判断される。
今後の研究の推進方策	ミュークリスタリンノックアウトマウスとワイルドタイプのレーザー誘発脈絡膜新生血管の比較、ミュークリスタリンノックアウトマウスとワイルドタイプのレーザー誘発脈絡膜新生血管モデルに対するDNAマイクロアレイ解析による脈絡膜新生血管関連遺伝子の検索、さらにDNAマイクロアレイにて検索された候補因子における発現解析をRT-PCR法、ウェスタンブロット法、免疫組織学法にて検討する予定である。
次年度の研究費の使用計画	DNAマイクロアレイに600,000円、実験動物の飼育に300,000円、RT-PCR、ウェスタンブロット法、免疫染色などに200,000の使用を検討している。23年度は当初計画で見込んだよりも安価に研究が完了したため、少額ではあるが次年度使用額が生じた。