ｓｉＲＮＡ技術を用いた遺伝子治療研究

2012 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 23792014
• 研究機関: 日本医科大学
• 研究代表者: 五十嵐 勉 日本医科大学, 医学部, 講師 (10421190)
• キーワード: 遺伝子治療 / 眼科 / 新生血管 / 抑制 / AAVベクター / siRNA / 脈絡膜新生血管

研究概要

マウスにおける遺伝子VEGFに対するsiRNAの配列についてデザインの決定を行った。選択された配列の遺伝子をAAV type8ベクターのベクタープラスミド(発現したい遺伝子をコード)に挿入した。ライゲーション、トランスフォーメーションを行って、クローンの単離を行った。クローンのシークエンスを確認し、プラスミドを精製後、発現を培養細胞にて確認後、AAV type8ベクターを作製した。次にAAV type8ベクターの発現を培養細胞にて確認後、ラージスケールにてベクターを作製し濃縮を行った。動物実験として脈絡膜新生血管モデルにおいて新生血管抑制効果を確認した。
また予備実験として、投与方法の検討を行った。マーカー遺伝子(EGFP, Luc)を発現するAAV type8ベクターを結膜下、硝子体、網膜下へ投与し、経時的に病理学的、電機生理学的、またIVISという屠殺しなくても同じ個体で遺伝子発現を観察できる系を用いて発現パターン、発現強度、多臓器への影響を検討した結果、結膜下は遺伝子発現が弱く、１年後においても硝子体、網膜下にはほぼ差がなく強発現していることが分かった。さらに網膜下投与は投与自体が網膜の障害になることをHE染色、GFAP染色、ERGにおいて示した。全身へのベクターの散布としては、結膜下投与の場合、肝臓において有意に上昇していたが、１ヶ月後ほぼ消失していた。Current eye researchに報告した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

予定していた脈絡膜新生血管モデルにおいてVEGFをsiRNAを用いて抑制効果を見ることに成功したため。

今後の研究の推進方策

今後、サイトカイン量などを確認し、新生血管抑制効果のメカニズムについて解析を行う。

次年度の研究費の使用計画

動物モデルを使用し、分子生物学的、免疫学的解析を行う予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Simultaneous treatment of pterygium and temporal conjunctivochalasis. (2013)
  • 著者名/発表者名: Suzuki H, Shiwa T, Oharazawa H, Igarashi T, Takahashi H.
  • 雑誌名: Journal of Nippon Medical School. 巻: 80 ページ: 74-77
  • DOI: 23470810
  • 査読あり
• [雑誌論文] Direct comparison of the administration routes for AAV8-mediated ocular gene therapy. (2013)
  • 著者名/発表者名: Igarashi T, Miyake K, Asakawa N, Miyake N, Shimada T, Takahashi T.
  • 雑誌名: Current eye research 巻: in press ページ: 0
  • 査読あり
• [雑誌論文] Rapid and Transient Upregulation of CCL11 (Eotaxin-1) in Mouse Ovary During Terminal Stages of Follicular Development. (2012)
  • 著者名/発表者名: Kuwabara Y, Katayama A, Igarashi T, Tomiyama R, Piao H, Kaneko R, Abe T, Mine K, Akira S, Orimo H, Takeshita T.
  • 雑誌名: Am J Reprod Immunol. 巻: 67 ページ: 358-68
  • 査読あり
• [雑誌論文] A case of juvenile Sjögren’s syndrome with interstitial nephritis. (2012)
  • 著者名/発表者名: Igarashi T, Itoh Y, Shimizu A, Igarashi T, Yoshizaki K, Fukunaga Y.
  • 雑誌名: Journal of Nippon Medical School. 巻: 79 ページ: 286-90
  • 査読あり
• [雑誌論文] Mometasone Furoate Nasal Spray Relieves the Ocular Symptoms of Seasonal Allergic Rhinoconjunctivitis. (2012)
  • 著者名/発表者名: Igarashi T, Nakazato Y, Kunishige T, Fujita M, Yamada Y, Fujimoto C, Okubo K, Takahashi H.
  • 雑誌名: Journal of Nippon Medical School. 巻: 79 ページ: 182-189
  • 査読あり
• [雑誌論文] A new mutation in RP1L1 gene in occult macular dystrophy patient associated with a depolarizing-pattern of focal macular ERG. (2012)
  • 著者名/発表者名: Kabuto T, Takahashi H, Goto-Fukuura Y, Igarashi T, Akahori M, Kameya S, Iwata T, Mizota A, Yamaki K, Miyake Y, Takahashi H.
  • 雑誌名: Molecular Vision. 巻: 18 ページ: 1031-9
  • 査読あり
• [雑誌論文] Mean hemoglobin levels in venous blood samples and prevalence of anemia in Japanese elementary and junior high school students. (2012)
  • 著者名/発表者名: Igarashi T, Itoh Y, Maeda M, Igarashi T, Fukunaga Y.
  • 雑誌名: Journal of Nippon Medical School 巻: 79 ページ: 232-235
  • 査読あり
• [学会発表] Rescue of Lethal Hypophosphatasia Mice by Neonatal Ex Vivo Gene Therapy Using Lentivirally Transduced Bone Marrow Cells. (2012)
  • 著者名/発表者名: Osamu Iijima, Koichi Miyake, Hanako Sugano-Tajima, Tsutomu Igarashi, Chizu Kanokoda, Atsushi Watanabe and Takashi Shimada.
  • 学会等名: American society of hematology
  • 発表場所: アトランタ
  • 年月日: 20120518-20120521