上皮間葉相互作用におけるＴｈｙｍｏｓｉｎβ１０と４の機能解析と歯の再生への応用

2011 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 23792106
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 和田 裕子 九州大学, 歯学研究科(研究院), 助教 (70380706)
• 研究期間 (年度): 2011-04-28 – 2014-03-31
• キーワード: 歯胚 / 発生・再生 / in situ hybridization / siRNA法 / 器官培養 / 間葉細胞 / 象牙芽細胞 / 分化

研究概要

１）マウス歯胚発生過程におけるThymosin b10(Tb10)とThymosin b4 (Tb4) のmRNAの発現様式の検索を行った。その結果、Tb10とTb4は時期特異的に異なる発現パターンを示した。Tb10は主に間葉細胞、象牙芽細胞に発現を認め、特に前象牙芽細胞から分化期象牙芽細胞にかけて発現が強かった。一方で、Tb4は主に上皮細胞、エナメル芽細胞に強く発現を認めた。また、定量解析では両遺伝子ともに下顎においては、歯堤形成時期である胎齢12日（E12)、歯胚においては帽状期であるE15、基質形成期である生後1日齢（P1）で発現量が増加した。以上のことから、Tb10は象牙芽細胞分化に、Tb4はエナメル芽細胞分化に関与している可能性が推察された。２）歯髄細胞株mDPにsiRNAを応用しTb10とTb4発現抑制による象牙質分化マーカー発現への影響の検討を行った。その結果、象牙質基質タンパクであるDMP-1とDSPP、転写因子であるRunx-2の発現量減少が認められた。Tb10は象牙芽細胞の分化や基質形成に関与していることが示唆された。３）器官培養を用いたTb10の発現抑制による歯胚形成への影響の検討を行った。E11下顎の器官培養にsiRNAを応用しTb10の発現を抑制し8日間培養した結果は、コントロール群では歯胚が帽状期に達しているのに対し、Tb10抑制群では歯胚は蕾状期のままで形態形成が抑制されていた。E15歯胚を同様の方法で8日間培養した結果は、Tb10抑制群ではコントロール群と比較して間葉細胞が少なく、間葉組織と上皮組織を裏返したようなinside-outの形態を呈した。Tb10は、歯胚の形態形成に関与していることが示唆された。これらの結果より、歯胚の発生過程においてTb10は象牙芽細胞の分化や基質形成および歯胚の形態形成に必要不可欠な因子であることが示唆された。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

本研究の目的は、歯胚発生過程におけるTb10の分子調節機構および機能を解析し、Tb4との比較検討を行い、Tb10とTb4が歯の上皮間葉相互作用および歯の形態形成にどのように関わっているか明らかにすることである。そのために、１）Tb10のmRNAの発現様式の検索を行い、２）歯髄細胞株mDPにおけるTb10発現抑制による象牙質分化マーカー発現への影響を検討し、３）器官培養を用いたTb10の発現抑制による歯胚形成への影響を検討した。これらの結果から、Tb10は象牙芽細胞の分化や基質形成および歯胚の形態形成に関与していることが示唆された。以上のように、歯胚発生過程におけるTb10の機能的役割について、確実に解明されつつある。また、現在それらのデータをまとめて論文作成中である。

今後の研究の推進方策

今後の予定は、まずTb10の強制発現による象牙質分化マーカーの発現調節の解析を行う。次に、共培養系を用いてTb10を強制発現した歯原性間葉細胞とTb4を強制発現した歯原性上皮細胞を入れ培養し、DSPP, DMP1, Runx2/Cbfa1, Amelogenin, Ameloblastin, Enamelin, MMP-2, MMP-9, Type IVcollagen, laminin等の発現量の変化をRealtime PCRとWestern blottingにより定量解析を行い、Tb10とTb4における上皮間葉相互作用に関する機能解析を行う。

次年度の研究費の使用計画

平成24年度の研究を遂行するために、分子生物学研究試薬、器官・細胞培養試薬、実験動物、組織標本作製試薬およびプラスティック器具等の消耗品費に使用する予定である。また、本研究の成果を国際誌に発表することを目指しており、その投稿料や校閲費に使用する予定である。さらに、国内学会での成果発表を考えており旅費に使用する予定である。下記に詳細を示す。分子生物学研究試薬　　４８０千円　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　器官・細胞培養試薬　　２４０千円　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　実験動物　　　　　　　　８０千円　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　組織標本作製試薬　　　　２０千円　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　プラスティック器具　　　２０千円　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　校閲・投稿料　　　　　１００千円　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　国内旅費　　　　　　　　６０千円

研究成果

• [雑誌論文] In situ expression of the mitochondrial ATPase6 gene in the developing tooth germ of the mouse lower first molar. (2011)
  • 著者名/発表者名: J Honda, H Wada, H Sakai et al.
  • 雑誌名: Journal of Molecular Histology 巻: 42 ページ: 83-90
  • DOI: 10.1007/s10735-010-9309-z
  • 査読あり
• [雑誌論文] 左側上顎に発生した石灰化嚢胞性歯原性腫瘍の１例 (2011)
  • 著者名/発表者名: 藤原弘明、和田裕子、坂井英隆、他
  • 雑誌名: 診断病理 巻: 28 ページ: 117-121
  • 査読あり
• [学会発表] 口唇部腫瘍 Soft tissue tumour of the lower lip
  • 著者名/発表者名: 和田裕子、坂井英隆、他
  • 学会等名: 第２２回日本臨床口腔病理学会、第５回アジア口腔病理学会
  • 発表場所: 福岡
  • 年月日: ２０１１年８月２４日
• [学会発表] 口唇部腫瘍
  • 著者名/発表者名: 和田裕子
  • 学会等名: 第３２１回九州・沖縄スライドコンファレンス
  • 発表場所: 福岡
  • 年月日: ２０１１年５月１４日
• [学会発表] 歯胚形成過程におけるThymosinβ-10の役割 ～Thymosinβ-4の比較検討～
  • 著者名/発表者名: 和田裕子、坂井英隆、他
  • 学会等名: 第１００回日本病理学会総会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: ２０１１年４月２８日
• [学会発表] 癌治療用アポソーシス誘導ベクターの作成と導入の試み
  • 著者名/発表者名: 古庄克宏、和田裕子、坂井英隆、他
  • 学会等名: 第５３回歯科基礎医学会学術大会ならびに総会
  • 発表場所: 岐阜
  • 年月日: ２０１１年１０月１日