|
多経路の DNA 修復に関わると予想される新規 DNA 修復タンパク質を複数の極限環境微生物ゲノム中に発見した。このタンパク質は N 末端側ドメインにアルキル化傷害修復タンパク質に類似した配列を持ち、C 末端側ドメインに脱アミノ傷害修復酵素、エンドヌクレアーゼ V (EndoV) に類似した配列を持つ。しかし、これらのタンパク質が関わる DNA 修復経路は全くの未知である。難培養性の株が多くゲノム未解明の種も多い極限環境では、AGT-EndoV と ATL-EndoV の関わる新規修復システムが、保存された重要な修復系である可能性も高く、その機能解明は基礎研究としても意義深い。
そこで私は、Thermoplasma acidophilum 由来 AGT-EndoV、Planctomyces brasiliensis 由来 ATL-endoVの発現系の構築に成功した。種々のカラムを用いて、本酵素を単一に精製することに成功し、精製方法を確立した。環状 DNA を用いたゲルシフトアッセイにより、DNA との結合が確認できた。また、本タンパク質の各ドメインの働きを調べるために、単独ドメインのみでの発現を試みた。ドメイン発現の方法を確立するため、ATL-EndoV と同様のアーキア由来複数ドメインタンパク質、PH0925 を用いて、マルトース結合タンパク質との融合状態での発現を試みた。その結果、N 末端側のみ、C 末端のみでの発現精製に成功し、それぞれのドメインでの本来の活性、ヌクレオチド転移活性とイソメラーゼ活性の検出に成功した。また、ATL 本来の単独の働きを調べるため、種々の修飾塩基を含む基質 DNA に対する親和性調べた。高度好熱菌由来 TTHA1564 は様々な大きさ、極性、電荷のアルキル化塩基に対し、強い基質特異性を示した。
|
