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齲蝕発症には齲蝕細菌(Streptococcus mutans )の歯面定着が深く関与しているが、これにはTwocomponent system(TCS)による環境適応が重要な役割を担っていると考えられている。しかしTCSの詳細はほとんど明らかにされていない。我々はTCSの構成成分であるセンサーキナーゼ(HK)とレスポンスレギュレータ(RR)の情報伝達ネットワークの解明を試みることにした。そのため、前年度に引き続き本年度は以下のような研究を行った。
(1)前年度に作製したS. mutans UA159株(野生株)の14種類のTCS、それぞれのHKおよびRRの欠損株、合計28種を用いて、様々な環境ストレスへの抵抗性の関与を検討した。いくつかの欠損株においてクロルヘキシジンへの抵抗性の減弱が確認できた。
(2)リン酸化タンパク質のwestern blot法、二次元電気泳動、TOF-MAS解析を用いた定量を検討していたが、その条件検討に必要な抗体を作製した。前年度に構築した発現ベクター(pGEX-CiaHおよびCiaR)を用いて、大腸菌に大量発現させ、グルタチオンカラムを用いた精製の後、受託業者に依頼し、ポリクローナル抗体を作製した。
(3)リン酸化検出に適した抗体や精製カラムを検討し、リン酸化反応の検出や定量を行えるように準備を進めている。市販のリン酸化タンパク質抽出カラムや検出試薬のほとんどは、リン酸化セリン、スレオニンを対象とするものがほとんどであり、TCSでリン酸化されるヒスチジンやアスパラギン酸のリン酸化検出に適するものは少ない。その中で見出したPhos-Tagシステムが我々の目的において使用できるか検討したが、リン酸基の検出が困難であり、リン酸化の検出を放射性同位元素を用いた方法を用いることにした。
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