| 今後の研究の推進方策 |
本年度はF１世代の生殖細胞の解析を予定している。
まずエピゲノムマーカーの免疫染色のためにF0およびF1個体の生殖巣を回収し、細胞死や増殖の異常、生殖細胞マーカーおよびヒストン修飾マーカーの発現異常を比較検討する。これに加えて、より詳細に異常を検出するためにGS 細胞を用いた生殖細胞の解析を行う。F1個体は継続して異常個体を産生するものの、これは一過性にしか存在できない分化細胞の異常では説明できない。したがって、持続して分裂する精子幹細胞に異常が蓄積している可能性が高い。精子幹細胞は数が少なく採取して解析することが難しいが、GS細胞を樹立することで精子幹細胞を無限に増幅することができる。そこでGS細胞をICSI F0, F1, F2個体から樹立し、以下の実験を行う。
(i) 遺伝子発現解析; F0-F2個体由来のGS細胞を樹立し、遺伝子発現の違いをRNAseqにより解析する。 (ii) ChIP シークエンス; H3K9me3, H3K9me2, H3K27me2/3,などは、精巣での発現パターンが老化に伴い変化する。これらのヒストン修飾に対する抗体を用いてF0とF1マウス由来のGS細胞でのパターンの違いを検討する。 (iii) 発現解析で得られた遺伝子機能の解析; ICSI F1マウスで同定された候補遺伝子の機能を調べるために、野生型GS細胞に遺伝子編集もしくは過剰発現を行う。改変したGS細胞を精巣に移植して得られた精子を用いて顕微受精を行い、ICSI F1世代と同様の異常が誘導できるかもを調べる。
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