| 研究課題/領域番号 |
23K05238
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| 研究機関 | 信州大学 |
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研究代表者 |
加藤 新平 信州大学, 学術研究院農学系, 准教授 (10533614)
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| 研究期間 (年度) |
2023-04-01 – 2027-03-31
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| キーワード | 病害抵抗性 / サリチル酸 / ペルオキシソーム / 中間体化合物 / 輸送機構 |
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| 研究実績の概要 |
遺伝子の発現抑制および過剰発現が容易なベンサミアナタバコを主な実験材料に用いて、以下の2つの小課題を実施した。
1. サリチル酸 (SA) 合成の中間体化合物の同定
我々が同定したSA合成に必要な5種類の酵素遺伝子 (CNL、CHD、KAT、HSR201、HSR203J) の発現をウイルス誘導性遺伝子発現抑制 (VIGS) で抑制すると、病原体ストレスに応答したSA蓄積量が減少する。この時、各酵素の基質化合物の蓄積量は反対に増加すると予想される。そのような基質化合物の同定は、1) SA合成が強力かつ特異的に活性化されるほど、2) VIGSによるSA蓄積量の減少が顕著であるほど容易になると期待された。5種類の酵素遺伝子の発現はCBP60型の転写因子により制御されており、CBP60の過剰発現はSAの蓄積を誘導する。また、CBP60はカルモジュリン (CaM) により活性化され、CaMの共発現はCBP60によるSA蓄積を増強する。そこで、CBP60とCaMを融合させた人工転写因子を作製したところ、本人工転写因子の過剰発現は莫大なSA蓄積を誘導した。ゲノムデータの解析より、CNLとKATには1つ、CHDには5つのホモログ遺伝子が存在することが明らかになった。CNLとそのホモログの両方の発現をVIGSで抑制したところ、病原体ストレスに応答したSA蓄積がCNL単独を抑制した場合よりも顕著に減少した。並行して、酵素の基質特異性をin vitroで解析するため、N末端にHisタグが付加されたHSR203Jの組換えタンパク質を作製・精製した。
2. SA合成の中間体化合物をペルオキシソーム内外に輸送する輸送体の遺伝子同定
SA合成に必要な5種類の酵素遺伝子と相関して発現するタバコの遺伝子群の中には、輸送体をコードすると予想される遺伝子が8種類存在する。これら8種類の遺伝子のベンサミアナのホモログ遺伝子を同定し、ホモログ遺伝子の発現が病原体ストレスにより誘導されることを確認した。また、VIGSに用いるウイルスベクターを構築した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
小課題1では、SA合成を強力に活性化する人工転写因子を作製することに成功した。また、ゲノムデータより各酵素遺伝子のホモログ遺伝子を同定し、CNLとそのホモログの両方を抑制すると、CNL単独を抑制するよりも顕著に病原体ストレスに応答したSA蓄積が減少することを明らかにした。これらの成果はCNLおよび残り4種の酵素の基質化合物を明らかにするのに有用である。並行して、酵素の基質特異性の解析に必要なHSR203Jの組換えタンパク質を作製・精製することに成功した。CNL、CHDおよびKATの組換えタンパク質は、既に作製・精製に成功しているため、残りはHSR201のみである。
小課題2では、5種類の酵素遺伝子と相関して発現する8種類の輸送体をコードすると予想されるタバコの遺伝子のホモログをベンサミアナタバコから同定した。また、ベンサミアナのホモログ遺伝子の発現が病原体ストレスにより誘導されることを確認し、VIGSに用いるウイルスベクターを構築した。
以上のことを総合し、本研究はおおむね順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
1. SA合成の中間体化合物の同定
CNLとそのホモログの両方をVIGSで抑制した植物の葉に人工転写因子を発現させ、対照植物よりも蓄積量が増加する化合物をHPLCで探索する。CNLとそのホモログを抑制した植物で面積が増加するピークが同定された場合は、ピークに含まれる化合物をPDAやMS/MSを用いて同定する。CHDおよびKATについては、ホモログ遺伝子がSA合成に関与するか調べる。ホモログ遺伝子がSA合成に関与することが明らかになった場合は、両方の遺伝子を抑制できるウイルスベクターを作製する。HSR201については、基質特異性を調べるための組換えタンパク質を作製・精製する必要があるが、N末端とC末端のどちらにHisタグを付加してもその活性が激減することが報告されている。そのため、組換えタンパク質の発現・精製方法を検討する。並行して、精製した各酵素の組換えタンパク質を用いてその基質特異性を調べる。
2. SA合成の中間体化合物をペルオキシソーム内外に輸送する輸送体の遺伝子同定
作製したウイルスベクターを用いて各輸送体遺伝子の発現をVIGSで抑制し、病原体ストレスに応答したSA蓄積におよぼす影響を明らかにする。SA合成に必要な輸送体遺伝子が同定された場合は、そのタンパク質の細胞内局在や輸送する化合物について詳細に解析する。
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