唾液腺腫瘍における特異的遺伝子再構成の切断点の不安定性と腫瘍悪性度との関係の解析

2023 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 23K06469
• 研究機関: 名古屋市立大学
• 研究代表者: 村瀬 貴幸 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 准教授 (40315875)
• 研究分担者: 稲垣 宏 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (30232507)
• 研究期間 (年度): 2023-04-01 – 2026-03-31
• キーワード: 分子病理 / 診断病理 / 遺伝子再構成 / 染色体転座 / 唾液腺腫瘍 / 免疫染色 / ＦＩＳH法 / 次世代シーケンサー法

研究実績の概要

申請者の関与した研究は、主に唾液腺悪性腫瘍に関する研究で、成果論文では病理検体を分子病理学的に解析し、腫瘍悪性度や予後との関係性について考察している。
①Shimoda H, Teshima M, Murase T, et al. Prognostic scores for patients with salivary adenoid cystic carcinoma without lymph node metastasis. Oral Oncol. 2023;145:106491. ②Ueda K, Murase T, Kawakita D, et al. The Landscape of MYB/MYBL1- and Peri-MYB/MYBL1-Associated Rearrangements in Adenoid Cystic Carcinoma. Mod Pathol. 2023;36:100274. ③Murase T, Nakano S, Sakane T, et al. Thymic Mucoepidermoid Carcinoma: A Clinicopathologic and Molecular Study. Am J Surg Pathol. 2022;46:1160-1169. ④Murase T, Ishibashi K, Okumura Y, et al. Pleomorphic adenoma: detection of PLAG1 rearrangement-positive tumor components using whole-slide fluorescence in situ hybridization. Hum Pathol. 2022;120:26-34. ⑤Nakano S, Okumura Y, Murase T, et al. Salivary mucoepidermoid carcinoma: histological variants, grading systems, CRTC1/3-MAML2 fusions, and clinicopathological features. Histopathology. 2022;80:729-735. ⑥Morita N, Murase T, Ueda K, et al. Pathological evaluation of tumor grade for salivary adenoid cystic carcinoma: A proposal of an objective grading system. Cancer Sci. 2021;112:1184-1195. ⑦Iwaki S, Kawakita D, Murase T, et al. Comprehensive genomic profiling of salivary gland carcinoma: Analysis of the Center for Cancer Genomics and Advanced Therapeutics database in Japan. Int J Cancer. 2024 Apr 30. doi:10.1002/ijc.34972. Epub. PMID: 38686510.

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

申請者の研究室では、200例以上の腺様嚢胞癌のMYB/MYBL1-NFIB遺伝子、200例以上の粘表皮癌のCRTC1/3-MAML2遺伝子の再構成の有無が明らかにされ、約100例の多形腺腫においてもPLAG1-X或いはHMGA2-X遺伝子の再構成の有無の確認を行いつつある。腺様嚢胞癌と粘表皮癌の各々50症例においては、特異的な遺伝子再構成の切断点の5、10メガベース上流・下流にプローブを設定して、切断点の不安定性を解析した結果が得られているため、それらのデータを踏まえて、蒐集された全唾液腺症例へと研究を本格化させた。蛍光免疫染色に関しては唾液腺悪性腫瘍で筋上皮系マーカーと腺上皮系マーカーの染色を行い、それぞれの蛍光免疫染色が問題なく実施できるかを確認した。Sequential FICTION-WSI法のシグナル解析により腫瘍細胞が正確に同定できるか確認後、3重蛍光(PD-L1(赤)、PD-L2(緑)、CEP9(アクア))のFISH解析を行い、それぞれの腫瘍の腫瘍細胞において遺伝子異常の分布状況を検索した。前述の技術により蛍光免疫染色で細胞形態の多様性を分類、腫瘍細胞単位で遺伝子異常を解析し、腫瘍内分布状況を分析した。腫瘍周囲の微小環境に関してもリンパ球系マーカー、免疫チェックポイント系マーカー、細胞内シグナル伝達系マーカー、細胞周期制御マーカーの抗体で蛍光免疫染色を行い、免疫担当細胞に発現する抗原を細胞単位で解析した。
研究をより効率的に進めるための方法として、1枚のFFPE標本にて細胞単位のFISH情報と蛍光免疫染色情報とを統合、比較できるソフトウェアを開発したが、データ容量の過多から多数症例への応用が難しい場合、症例毎にソフトウェアの最適化を予定している。さらに、データ容量過多が避けられない場合においては、組織アレイ・スライドを導入し、多数症例に対応する予定である。

今後の研究の推進方策

申請者の研究室では、200例以上の腺様嚢胞癌のMYB/MYBL1-NFIB遺伝子、200例以上の粘表皮癌のCRTC1/3-MAML2遺伝子の再構成の有無が明らかにされ、約100例の多形腺腫においてもPLAG1-X或いはHMGA2-X遺伝子の再構成の有無の確認を行いつつあり、蒐集された全唾液腺症例へと研究を本格化させているが、更なる症例の蒐集を目指す。
次世代シーケンサー iSeq100(イルミナ社)による検体作製や解析ソフトウェアにおいては既に設定が完了しているが、検体作製に関しては当大学血液内科の専門家とのカンファレンスを、ソフトウェア解析に関しては京都大学のジェノモン・システムの利用を予定し、実験結果の精度向上を図る。症例毎に遺伝子ビッグデータと組織形態ビッグデータを比較できるソフトウェアの開発は完成しているが、多数症例に応用できないため、症例毎にソフトウェアを最適化させることを予定している。
1枚のFFPE標本にて細胞単位のFISH情報と蛍光免疫染色情報とを統合、比較できるソフトウェアの開発は完了しているが、データ容量過多から多数症例への応用が難しい場合、症例毎にソフトウェアの最適化を予定している。さらに、データ容量過多が避けられない場合においては、組織アレイ・スライドを導入し、多数症例に対応する予定である。
分子病理診断への応用に関しても、特異的な遺伝子異常の確立されている唾液腺悪性腫瘍を対象としてvalidation testをする予定である。
本研究をさらに他の腫瘍に応用する。申請者の研究室には唾液腺悪性腫瘍(500例以上)に加え、胸腺上皮性腫瘍(200例以上)、多発性骨髄腫(200例以上)が蒐集されているので、それらの腫瘍の解析を念頭に置いている。

次年度使用額が生じた理由

(1):研究対象症例が予想以上に集塊できたため、それらの症例に対する遺伝子解析実験に充てられる物品費が増加した。
(2):同一切片使用の組織FISH法の複数回試行実験に充てられる物品費も(1)に比例して増加した。
状況(1)(2)を解消するため、次年度からは遺伝子解析実験や組織FISH法複数回試行実験の精度を向上させ、効率化を図る予定である。
実験物品としては、1次抗体、最適化蛍光2次抗体、再設計FISHプローブ、多重プローブとそれらに伴うキット試薬が必要と考えられ、購入を予定している。具体的には、現行の唾液腺腫瘍、造血器腫瘍、縦隔腫瘍に関連する抗体・プローブ・関連試薬に加え、PD-L1遺伝子やIgH遺伝子の状態を解析するプローブ・関連試薬である。

備考

Murase T, et al. Thymic Mucoepidermoid Carcinoma: A Clinicopathologic and Molecular Study. Am J Surg Pathol. 2022 Aug 1;46(8):1160-1169. doi: 10.1097/PAS.0000000000001886. PMID: 35319525.

研究成果

• [国際共同研究] University Hospital Basel(スイス)
  • 国名: スイス
  • 外国機関名: University Hospital Basel
• [国際共同研究] Nat Tuberculosis & Lung Dis Res Inst(ポーランド)
  • 国名: ポーランド
  • 外国機関名: Nat Tuberculosis & Lung Dis Res Inst
• [国際共同研究] Johannes Gutenberg University/Heidelberg University(ドイツ)
  • 国名: ドイツ
  • 外国機関名: Johannes Gutenberg University/Heidelberg University
• [国際共同研究] Mayo Clinic Rochester(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: Mayo Clinic Rochester
• [雑誌論文] Fluorescent periodic acid Schiff-like staining combined with standard cytologic staining of the same cytologic specimen may facilitate cytopathologic diagnosis. (2024)
  • 著者名/発表者名: Hachisuka D, Nakano S, Takase H, Sugiyama M, Sugiura M, Fujii K, Masaki A, Murase T, Inagaki H.
  • 雑誌名: Diagn Cytopathol. 2024 Mar;52(3):139-144. 巻: 52 ページ: 139-144
  • DOI: 10.1002/dc.25256.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Prognostic scores for patients with salivary adenoid cystic carcinoma without lymph node metastasis. (2023)
  • 著者名/発表者名: Shimoda H, Teshima M, Murase T, Nagao T, Kusafuka K, Nakaguro M, Urano M, Taguchi KI, Yamamoto H, Kano S, Tada Y, Tsukahara K, Okami K, Onitsuka T, Fujimoto Y, Kawakita D, Sakurai K, Hanai N, Nagao T, Kawata R, Hato N, Nibu KI, Inagaki H.
  • 雑誌名: Oral Oncol. 2023 Oct;145:106491. 巻: 145 ページ: 106491
  • DOI: 10.1016/j.oraloncology.2023.106491.
  • 査読あり
• [雑誌論文] The Landscape of MYB/MYBL1- and Peri-MYB/MYBL1-Associated Rearrangements in Adenoid Cystic Carcinoma. (2023)
  • 著者名/発表者名: Ueda K, Murase T, Kawakita D, Nagao T, Kusafuka K, Nakaguro M, Urano M, Yamamoto H, Taguchi KI, Kano S, Tada Y, Tsukahara K, Okami K, Onitsuka T, Fujimoto Y, Sakurai K, Hanai N, Nagao T, Kawata R, Hato N, Nibu KI, Inagaki H.
  • 雑誌名: Mod Pathol. 2023 Oct;36(10):100274. 巻: 36 ページ: 100274
  • DOI: 10.1016/j.modpat.2023.100274.
  • 査読あり
• [雑誌論文] 7-Amino-4-methylcoumarin as a fluorescent substitute for Schiff's reagent: a new method that can be combined with hemalum and eosin staining on the same tissue section. (2023)
  • 著者名/発表者名: Takase H, Murase T, Hachisuka D, Sakamoto Y, Sugiura M, Nakano S, Fujii K, Masaki A, Inagaki H.
  • 雑誌名: Biotech Histochem. 2023 Jan;98(1):54-61. 巻: 98 ページ: 54-61
  • DOI: 10.1080/10520295.2022.2101144.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Importance of the Number and Location of Lymph Node Metastasis in Oropharyngeal Cancer. (2023)
  • 著者名/発表者名: Iida M, Murai T, Kuno M, Osumi K, Nakanishi-Imai M, Okazaki D, Murase T, Kawakita D, Iwasaki S, Inagaki H, Tomita N, Shibamoto Y, Hiwatashi A.
  • 雑誌名: In Vivo. 2023 Sep-Oct;37(5):2210-2218. 巻: 37 ページ: 2210-2218
  • DOI: 10.21873/invivo.13321.
  • 査読あり
• [学会発表] 唾液腺腺様嚢胞癌cN0/pN0症例における予後スコアの作成 (2023)
  • 著者名/発表者名: 下田 光, 手島 直則, 村瀬 貴幸, 長尾 俊孝, 草深 公秀, 中黒 匡人, 浦野 誠, 田口 健一, 山元 英崇, 加納 里志, 多田 雄一郎, 塚原 清彰, 大上 研二, 鬼塚 哲郎, 藤本 保志, 川北 大介, 櫻井 一生, 花井 信広, 長尾 徹, 河田 了, 羽藤 直人, 丹生 健一, 稲垣 宏.
  • 学会等名: (一社)日本頭頸部癌学会
• [学会発表] 唾液腺腺様嚢胞癌におけるMYB/MYBL1遺伝子関連異常の検索 (2023)
  • 著者名/発表者名: 上田 佳緒璃, 村瀬 貴幸, 川北 大介, 長尾 俊孝, 草深 公秀, 中黒 匡人, 浦野 誠, 山元 英崇, 田口 健一, 加納 里志, 多田 雄一郎, 塚原 清彰, 大上 研二, 鬼塚 哲郎, 藤本 保志, 櫻井 一生, 花井 信広, 長尾 徹, 河田 了, 羽藤 直人, 丹生 健一, 稲垣 宏.
  • 学会等名: (一社)日本頭頸部癌学会
• [学会発表] 褐色細胞腫クリーゼの亜急性期に副腎腫瘍摘出によって循環動態が改善した1例 (2023)
  • 著者名/発表者名: 加藤 春佳, 青谷 大介, 位田 敬明, 浜田 けい子, 竹田 勝志, 伊藤 隆彦, 服部 麗, 小山 博之, 中野 さつき, 太田 裕也, 河田 侑, 村瀬 貴幸, 安井 孝周, 瀬尾 由広, 田中 智洋.
  • 学会等名: (一社)日本内分泌学会
• [学会発表] 乳癌センチネルリンパ節生検で発見された原発不明悪性黒色腫の2例 (2023)
  • 著者名/発表者名: 杉山 美緒, 正木 彩子, 杉浦 真理子, 中野 さつき, 藤井 慶一郎, 津田 香那, 村瀬 貴幸, 稲垣 宏.
  • 学会等名: (一社)日本病理学会
• [学会発表] 肉芽腫を伴わず、膿瘍形成の目立った抗酸菌感染症の2例 (2023)
  • 著者名/発表者名: 杉浦 真理子, 村瀬 貴幸, 杉山 美緒, 中野 さつき, 藤井 慶一郎, 津田 香那, 正木 彩子, 服部 日出雄, 稲垣 宏.
  • 学会等名: (一社)日本病理学会
• [備考] Thymic Mucoepidermoid Carcinoma
  • URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35319525/