• 研究課題をさがす
  • 研究者をさがす
  • KAKENの使い方
  1. 課題ページに戻る

2023 年度 実施状況報告書

ボルデテラ属細菌によるBteA依存的な細胞死誘導機構の解析

研究課題

研究課題/領域番号 23K06531
研究機関北里大学

研究代表者

桑江 朝臣  北里大学, 感染制御科学府, 准教授 (60337996)

研究期間 (年度) 2023-04-01 – 2026-03-31
キーワード百日咳 / III型分泌装置 / エフェクター
研究実績の概要

ボルデテラ属細菌は多くのグラム陰性病原菌が産生するIII型分泌機構を有している.本研究ではボルデテラ属細菌のIII型分泌装置から分泌されるBteAと呼ばれるタンパク質の機能解析を行っている.これまでにBteAが菌体内から宿主細胞内へ移行することが示されており,そのBteAの移行にBopNと呼ばれるIII型分泌装置から分泌されるタンパク質との相互作用が重要であることが示唆されていたが,BteAの宿主細胞内移行に関する詳細な移行のメカニズムは不明であった.そこでBteAのいずれの領域が,BopNによる宿主細胞内移行制御を受けるのかを解析するために,BteAの様々な部分欠失変異体をコードするプラスミドをBopN産生株とBopN非産生株に導入した.BteAの部分欠失変異体の産生および分泌を確認した後,部分欠失変異体の宿主細胞内への移行を解析したところ,BteAの中央部分とC末端部分の2箇所においてBopNによる移行制御を受けることが示唆された.AlphaFold2を用いて,BteAとBopNの相互作用に重要なBteA内のアミノ酸を予想し,アラニンによって置換した変異体を産生する菌株を用いて,BteAの移行試験を行ったところ,BopNによる移行制御に重要なアミノ酸が複数箇所見出された.BteAとBopNが菌体内で相互作用を行っているか解析を行うために,大腸菌内で組換え型のBteAとBopNを産生させ,タンパク質の精製を行った.その結果,BteAの中央領域とBopNが相互作用していることが強く示唆された.

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

当初はプルダウンアッセイにおいてBteAが非特異的にセファロースビーズに吸着してしまい,相互作用試験が困難であったため,GSTタグの下流にTurbo 3Cプロテアーゼの認識配列を有するBopNとの融合タンパク質を大腸菌に産生させ,プルダウンアッセイを試みた.Turbo 3CプロテアーゼによりBopNと相互作用しているBteAを上清中に遊離させることにより,非特異的にセファロースビーズに吸着しているBteAを除去することに成功した.その結果,BopNがBteAの中央領域と相互作用することが強く示唆された.
部分欠失変異体を用いた試験では変異体の構造が野生型の構造と大きく異なっている可能性があるため,非特異的な相互作用を検出してしまう可能性が考えられる.そこで,構造を大きく変化させることを避けるため,BteAの点変異体の作製を行った.点変異体のボルテテラ属細菌における産生および分泌量は野生型と同様であったが,宿主細胞内移行が認められない点変異体をえることに成功した.

今後の研究の推進方策

他機関との共同研究等を通して,BteAとBopNの相互作用を構造学的に予測し,互いのタンパク質内で相互作用に必要なアミノ酸をより詳細に解析する.現在までに得られている宿主細胞内への移行能を喪失したBteAの点変異体がBopNと相互作用するのか否か,確認を行う.BopNとBteAが菌体内のみではなく,宿主細胞内においても相互作用をするのか否か,培養細胞を用いた試験を行う.具体的にはBteAとBopNを培養細胞に共発現させた後,BteAとBopNの局在を蛍光顕微鏡を用いて解析を行う.これらの培養細胞から溶解液を調製し,プルダウンアッセイを行うことにより,相互作用が認められるかウエスタンブロットにより解析を行う.
BteAが宿主細胞内に移行した後に,いずれの宿主側因子と相互作用するのか,引き続き解析を進める.今後は,共同研究を通してタンパク質の相互作用データベースの情報を用いて,機械学習によってBteAと相互作用するタンパク質の同定を試みる.現在までに予想されている相互作用因子や,新たに相互作用することが予想されたタンパク質とBteAのプルダウン試験を行う.またそれらの因子をノックアウトした細胞を作製し,BteA依存的な細胞死が誘導されるか否かを解析する.

次年度使用額が生じた理由

ボルデテラ属細菌の産生する病原因子であるBteAは哺乳類細胞が産生する因子と相互作用する可能性が高い.研究開始当初はBteAと相互作用することが予測されたタンパク質の抗体の購入や,哺乳類細胞を培養するための牛胎児血清を購入予定であったが,BteAとBopNの相互作用の研究の方が順調に進行したため,これらの抗体や血清を購入しなかった.次年度以降に必要となったとき,購入する予定である.

  • 研究成果

    (6件)

すべて 2024 2023

すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 2件) 学会発表 (3件) (うち招待講演 1件)

  • [雑誌論文] Correlation between the spread of IMP-producing bacteria and the promoter strength of blaIMP genes2024

    • 著者名/発表者名
      Kikuchi Yuta、Yoshida Mariko、Kuwae Asaomi、Asami Yukihiro、Inahashi Yuki、Abe Akio
    • 雑誌名

      The Journal of Antibiotics

      巻: 77 ページ: 315-323

    • DOI

      10.1038/s41429-024-00715-5

    • 査読あり
  • [雑誌論文] PurA is the main target of aurodox, a type III secretion system inhibitor2024

    • 著者名/発表者名
      Watanabe Yoshihiro、Haneda Takeshi、Kimishima Aoi、Kuwae Asaomi、Suga Takuya、Suzuki Takahiro、Iwabuchi Yoshiharu、Honsho Masako、Honma Sota、Iwatsuki Masato、Matsui Hidehito、Hanaki Hideaki、Kanoh Naoki、Abe Akio、Asami Yukihiro、?mura Satoshi
    • 雑誌名

      Proceedings of the National Academy of Sciences

      巻: 121 ページ: -

    • DOI

      10.1073/pnas.2322363121

    • 査読あり
  • [雑誌論文] BteAによる細胞死誘導機構2023

    • 著者名/発表者名
      桑江朝臣
    • 雑誌名

      Medical Science Digest

      巻: 49 ページ: 510-511

  • [学会発表] ボルデテラ属細菌のIII型分泌装置とエフェクターの機能解析2024

    • 著者名/発表者名
      桑江朝臣
    • 学会等名
      日本薬学会第144年会
    • 招待講演
  • [学会発表] Bordetella属細菌の産生するタンパク質BteAとBopNの相互作用領域の解析2023

    • 著者名/発表者名
      小河俊伸,桑江朝臣,阿部章夫
    • 学会等名
      第106回日本細菌学会関東支部総会
  • [学会発表] Bordetella属細菌の産生するタンパク質BcrH2の機能解析2023

    • 著者名/発表者名
      宮杉真帆,桑江朝臣,阿部章夫
    • 学会等名
      第106回日本細菌学会関東支部総会

URL: 

公開日: 2024-12-25  

サービス概要 検索マニュアル よくある質問 お知らせ 利用規程 科研費による研究の帰属

Powered by NII kakenhi