| 研究課題/領域番号 |
23K06839
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| 研究機関 | 公益財団法人東京都医学総合研究所 |
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研究代表者 |
大岡 静衣 公益財団法人東京都医学総合研究所, 精神行動医学研究分野, 主席研究員 (80313097)
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| 研究分担者 |
西澤 大輔 公益財団法人東京都医学総合研究所, 精神行動医学研究分野, 主席研究員 (80450584)
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| 研究期間 (年度) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| キーワード | HS3ST4 / 転写開始 / 慢性疼痛 / 一塩基多型 |
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| 研究実績の概要 |
Heparan sulfate-glucosamine 3-O-sulfotransferase 4（HS3ST4）検出の効率化を図るため、CRISPR-Cas9 ゲノム編集により、HiBiT タグを HS3ST4 の C 末端にノックイン（HS3ST4-HiBiT）した神経培養細胞を作製した。HiBiT タグは、LgBiT サブユニットに高親和性で結合し、ルシフェレース活性を示すことから、抗 HS3ST4 抗体を介さない全長・欠失 HS3ST4-HiBiT の ウエスタンブロッティングを行った。しかし、期待された感度は得られず、現状では抗体による検出の方が高感度であった。
胎児脳等でプロモーター・エンハンサー領域であり、疼痛関連一塩基多型を含む新規転写開始領域上流配列を抽出し、その下流に蛍光蛋白質またはルシフェレースを発現するプラスミド、およびそのプロモーター・エンハンサー領域の欠損変異体を作製し、神経培養細胞に導入し、蛍光顕微鏡観察またはルシフェレースアッセイを行った。新規転写開始領域上流配列中の転写開始活性の高い領域が判明した。また、新規転写開始領域から産生される新規部分欠失HS3ST4が、サイトメガロウイルスプロモーター、EF1αプロモーター活性を促進することを明らかにした。新規部分欠失HS3ST4は、転写の場である核内にも存在することを確認した。
新規転写開始領域に結合する転写因子の高精度予測ツールで、低 P 値（P < 10^-5）で予測され、組織特異的・発達時期特異的発現特性が全長・欠失 HS3ST4 mRNA 発現と合致する転写因子候補を特定した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ヒトサンプル解析等予定より遅れている部分もあるが、プロモーター活性解析等進展している部分もあり、総合的に見ておおむね予定通りに進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
HS3ST4 イントロン新規転写開始部位および部分欠失HS3ST4に関する解析をさらに進める。それらの結果が出次第、ヒトサンプル解析に着手する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
年度末に緊急修理等必要な場合に備えて若干予算を残した。次年度早々に必要なプライマー、酵素等試薬や故障したHDの購入に充てる。
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