| 研究課題/領域番号 |
23K07017
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| 研究機関 | 琉球大学 |
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研究代表者 |
高松 岳矢 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (90801431)
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| 研究分担者 |
高江洲 義和 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (90421015)
魏 范研 東北大学, 加齢医学研究所, 教授 (90555773)
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| 研究期間 (年度) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| キーワード | 双極性障害 / iPS細胞 / 神経細胞 / 精神疾患 / ミトコンドリア |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、以前我々が双極性障害と反復性うつ病の多発家系の患者で低下していることを見出した遺伝子Aのスプライシングバリアント(アイソフォームAx)の機能を解明し、Axの低下と双極性障害の病態の関連を明らかにすることを目的とする。
2023年度は当初計画に沿ってAxノックダウンベクターの作成にとりかかったが、予想以上にAxは特異的なノックダウンが難しく、時間がかかった。ノックダウンは、最終的にAxに特異的なshRNAを4種類デザインして、pLKO.1ベクターに挿入してベクターを作成し、セルラインを用いてAxのノックダウンが確認できた2つのベクターを選択した。感染性のあるレンチウイルスにパッケージングして凍結保存を行った。またAxの発現ベクターの作成も行った。
並行して、遺伝子Aのすべてのアイソフォームをノックダウンする実験系を確立し、ヒト細胞株でのミトコンドリア膜電位、活性酸素種などのデータを収集した。
以上のように、2023年度は本研究の基盤となるAxのノックダウンベクター、発現ベクターの作成と関連したミトコンドリア膜電位などの細胞機能のデータの収集に成功した。次年度、これらの実験系を使ってAxの細胞での機能を明らかにしていく。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初計画よりやや遅れている理由として、以下の4点を挙げる。(1) Axの特異的なノックダウンが予想より難しかった。(2)メーカーの販売停止により、酸素消費量測定のために計画していた細胞外フラックスアナライザーが使用できなくなった。(3)メーカーの販売停止により、遺伝子Aのアイソフォームパターンの解析のために計画していたデジタルPCRが使用できなくなった。(4)物価高騰により研究試薬全般の使用に一定の制限が必要になった。
(1) AxノックダウンiPS細胞を早期に作成し、これを用いて細胞機能の解析を行いたかったがベクターの作成に時間を要したため、当初計画よりやや遅れている。ただし想定した範囲の問題であり、次年度も実験を継続する。(2)共同研究者の所有しているAgilent社細胞外フラックスアナライザーを使用して酸素消費量を測定する計画であったが、2023年にAgilent社が当機器の消耗品の販売を終了したため、解析ができなかった。計画を変更せざるを得なくなり、研究にやや遅れが生じた。細胞を輸送できる範囲（沖縄本島内）に細胞外フラックスアナライザーはなく、現在蛍光試薬など他の方法での酸素消費量の解析が可能かを検討している。(3)琉球大学が所有するThermoFisher社のQuantStudio3Dシステム（デジタルPCR）を使って遺伝子Aのアイソフォームパターンの定量を行う計画であったが、この機器も消耗品が販売終了になり、使用を断念した。現在計画をどう実施するかを考えており、当初よりもやや遅れが生じている。(4)ほぼ全ての品目に値上がりがあり、スケールダウンして研究を行ったため、やや遅れが生じている。
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| 今後の研究の推進方策 |
アイソフォーム Axの機能と病的意義を明らかにするため、(研究計画1) Axの機能の解析、(研究計画2) ヒト神経細胞でのAxのノックダウンとレスキュー実験、(研究計画3) ヒト血液検体での遺伝子Aアイソフォームパターンの測定実験を行う。
研究計画1: レンチウイルスベクターからウイルスを作成し、ヒト由来細胞株にAxを過剰発現およびノックダウンさせ、ミトコンドリア膜電位、活性酸素種などを測定し、Axがミトコンドリアでどのような機能をもつのかを明らかにする。酸素消費量は蛍光試薬による測定をセットアップする。研究計画2: 神経細胞におけるAxの役割を明らかにするため、ヒトiPS細胞由来神経細胞でAxのノックダウンと過剰発現を行い、ミトコンドリア機能と神経活動性をイメージング等により解析する。研究計画3:ヒト血液での遺伝子Aのアイソフォームパターンの測定では、アイソフォームパターンを定量するプローブを作成し、デジタルPCRで定量する計画であった。しかし、計画したデジタルPCR機器が使用できなくなったため、リアルタイムPCRで解析が可能かを検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
Axを過剰発現およびノックダウンさせたヒトiPS細胞を作成したのち、ミトコンドリア膜電位、活性酸素種などを測定する計画だったが、今年度に細胞が完成しなかったため、ミトコンドリア膜電位、活性酸素種などを測定する試薬の費用が残った。次年度細胞が完成したら、次年度の請求する助成金と合わせて、測定試薬を購入し、実験を行う。
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