| 研究課題/領域番号 |
23K07699
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| 研究機関 | 鳥取大学 |
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研究代表者 |
板場 則子 鳥取大学, 医学部, 助教 (70457167)
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| 研究期間 (年度) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| キーワード | セクレトーム / MSC / 線維症 |
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| 研究実績の概要 |
温度応答性培養皿上で間葉系幹細胞に低分子化合物IC-2を添加し作製する「肝疾患治療用細胞シート」は、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）-1, -14を主とした抗線維化因子のtrophic actionにより肝硬変モデルマウスで肝線維化を抑制する。同シートの濃縮培養上清からなるセクレトームはin vitroにて腎線維芽細胞の活性化を抑制することから、同シートの分泌因子には腎線維化抑制因子が含まれると考えられる。
本研究では、腎線維化治療に適した再生医療技術の開発を目指し、肝疾患治療用細胞シートのセクレトーム中の腎線維化抑制因子の同定を通して、腎線維化抑制因子を増強したデザイナー細胞を開発し、Proof of Concept (POC)を得ることを目的とする。
肝疾患治療用細胞シートの濃縮培養上清からなるセクレトームのうち、in vitroにて腎線維芽細胞活性化抑制作用を示す因子は、限外ろ過法による分画の結果、50kDa~100kDaの分画に含まれる事をこれまでの研究で明らかにしている。本研究では、当該分画をゲルろ過クロマトグラフィー法によりさらに50分画後に、腎線維芽細胞活性化抑制作用を示す分画を絞り込み、該当分画に含まれるタンパクをLC-MS/MSショットガン解析で明らかにした。既取得済みとなるLC-MS/MS Tandem Mass Tag (TMT)解析によるIC-2添加セクレトームとコントロールセクレトームとの比較解析データを活用し、LC-MS/MSショットガン解析データとでデータを統合解析することで、両解析で重複する因子を抽出し、含量の多いものから順に6因子を候補に挙げた。各候補因子は、qPCRによりvalidationを実施し、それぞれIC-2により間葉系幹細胞で発現が上昇することを確認した。今後、候補因子の機能解析を進める予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
LC-MS/MSショットガン解析に供する試料の大量調整のためセクレトーム回収時の培養をスケールアップしたところ、該当分画にて目的とする腎線維芽細胞活性化抑制効果が確認できなかった。小スケールでは再現性が得られることから、大量調整時に濃縮率を上げることが要因の一つと考えられた。原因究明と対策の確立のために当初計画より遅れが生じたが、当初計画にて今年度予定していた候補因子の機能解析に着手するところまで遅れは解消している。おおむね順調には進んでいるものの、当初計画よりやや遅れが生じていると言う状況である。
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| 今後の研究の推進方策 |
LC-MS/MSショットガン解析データならびにLC-MS/MS Tandem Mass Tag (TMT)解析データの統合解析により抽出した6つの腎線維化抑制因子候補の機能解析を進める。機能解析用の各候補因子のノックダウン用のshRNA発現レンチウイルスは、今年度中にそれぞれ作製を終えたため、これらのレンチウイルスを間葉系幹細胞に導入することで、候補因子をdepleteしたセクレトームをそれぞれ回収するところより開始する。各候補因子をそれぞれdepleteしたセクレトームで腎線維芽細胞活性化抑制効果に対する影響をin vitroにて評価し、in vivo評価へと進める腎線維化抑制因子候補を絞り込む予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度計画であった候補因子の機能解析に遅れが生じているため、この計画の遂行に必要な経費分、次年度使用額が生じた。次年度はこの機能解析より進めるため、次年度内にて今年度未使用経費を使用する予定である。
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