ECFCにおけるV2 vasopressin receptorの局在・機能解析によるVWF分泌刺激機構の解明

2023 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 23K07856
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 松下 正 名古屋大学, 医学部附属病院, 教授 (30314008)
• 研究分担者: 鈴木 伸明 名古屋大学, 医学部附属病院, 講師 (70637686) ; 岡本 修一 名古屋大学, 医学系研究科(保健), 助教 (80899675)
• 研究期間 (年度): 2023-04-01 – 2026-03-31
• キーワード: 血液学 / von Willebrand因子 / factor VIII / ECFC / DDAVP / バソプレシンV2受容体 / V2R

研究実績の概要

ヒト末梢血単核球から樹立されるendothelial colony forming cell (ECFC)は，血管内皮細胞のex vivoモデルであり，von Willebrand因子 (VWF)の発現状態を生体外で再現することを可能にする。本研究では，VWD患者由来のECFCを用いて，酢酸デスモプレシン (DDAVP)によるVWF分泌刺激作用を細胞のレベルで多角的に検討する．
まず，ECFCにおけるバソプレシンV2受容体 (V2R)の発現について一定の見解は得られていないため，それを確認することが実験系の確立に必須である．そこでECFCにおいて逆転写PCR (RT-PCR)，Western blotting (WB)，免疫染色によりV2Rの検出を試みた．陽性対照としてはヒト肺微小血管内皮細胞 (HPMEC)を，陰性対照としてヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVEC)を用いた．RT-PCRとWBの結果から，ECFCにもmRNA，蛋白質レベルでV2Rが発現していることが示された．免疫染色標本の共焦点顕微鏡観察によってもECFCにおけるV2R発現が確認されたが，ECFCではHPMECよりもその発現強度は低かった．
今年度にかけて，実際にVWD患者のECFCからのVWF分泌を評価するために，添加するDDAVPの至適濃度と作用時間を検討している．マルチウェルプレートの面積と，播種細胞数，DDAVP濃度の調整によって，再現性の高いアッセイ系の確立を行っている．

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

予備的な検討としてECFCにおけるバソプレシンV2受容体 (V2R)の発現について確認することが実験系の確立に必須であった．岡本とともにECFCにおいて逆転写PCR (RT-PCR)，Western blotting (WB)，免疫染色によりV2Rの検出を試み、RT-PCRとWBではECFCにもmRNA，蛋白質レベルでV2Rが発現していることを確認した．免疫染色標本の共焦点顕微鏡観察によってもECFCにおけるV2R発現が確認されたが，ECFCではHPMECよりもその発現強度は低かったため．
今年度にかけて，実際にVWD患者のECFCからのVWF分泌を評価するために，添加するDDAVPの至適濃度と作用時間を検討している．ここまで計画範囲内で推移できていると考えている

今後の研究の推進方策

今年度の検討によって，mRNA，蛋白レベルでECFCにおけるV2Rの存在が明らかとなった．実際に，VWD患者由来ECFCにおけるDDAVP反応性を検討していくにあたり，ECFCに添加するDDAVPの至適濃度とその反応時間を検討する必要がある．これらの条件を最適化した上で培養上清中へのVWF分泌を定量する。定量にあたっては高感度enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)による上清中VWF濃度の測定を実施する．また，V2R拮抗薬存在下でのVWF分泌の変化を検討し，ECFCにおけるVWF分泌に対するV2Rの機能を明らかにしていく．

次年度使用額が生じた理由

ECFCに添加するDDAVP等の至適濃度とその反応時間を検討するにあたり、必要な各種試薬、測定キット、細胞株の発注を予定していたが納期遅延が発生したことが主因である。

研究成果

• [雑誌論文] Fitusiran prophylaxis in people with hemophilia A or B who switched from prior BPA/CFC prophylaxis (ATLAS-PPX) (2024)
  • 著者名/発表者名: Kenet G, Nolan B, Zulfikar OB, Antmen B, Kampmann P, Matsushita T,et al.
  • 雑誌名: Blood Journal 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1182/blood.2023021864
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Variability in combinations of APTT reagent and substrate plasma for a one‐stage clotting assay to measure factor VIII products (2024)
  • 著者名/発表者名: Suzuki Atsuo、Suzuki Nobuaki、Kanematsu Takeshi、Okamoto Shuichi、Suzuki Naruko、Tamura Shogo、Kikuchi Ryosuke、Katsumi Akira、Kojima Tetsuhito、Matsushita Tadashi
  • 雑誌名: International Journal of Laboratory Hematology 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1111/ijlh.14258
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Basement membrane extract potentiates the endochondral ossification phenotype of bone marrow-derived mesenchymal stem cell-based cartilage organoids (2024)
  • 著者名/発表者名: Notoh Hinako、Yamasaki Satoshi、Suzuki Nobuaki、Suzuki Atsuo、Okamoto Shuichi、Kanematsu Takeshi、Suzuki Naruko、Katsumi Akira、Kojima Tetsuhito、Matsushita Tadashi、Tamura Shogo
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 巻: 701 ページ: 149583～149583
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2024.149583
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Interim analyses of the multinational real‐world prospective cohort HEM‐POWR study evaluating the effectiveness and safety of damoctocog alfa pegol in patients with hemophilia A (2023)
  • 著者名/発表者名: Reding Mark T.、Alvarez-Roman MT、Castaman Giancarlo、Janbain Maissaa、Matsushita Tadashi、Meijer Karina、Schmidt Kathrin、Oldenburg Johannes
  • 雑誌名: European Journal of Haematology 巻: 112 ページ: 286～295
  • DOI: 10.1111/ejh.14114
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] The immunogenicity, safety, and efficacy of N8-GP in previously untreated patients with severe hemophilia A: pathfinder6 end-of-trial results (2023)
  • 著者名/発表者名: Kenet Gili、Young Guy、Chuansumrit Ampaiwan、Matsushita Tadashi、Yadav Vandana、Zak Marek、Male Christoph
  • 雑誌名: Journal of Thrombosis and Haemostasis 巻: 21 ページ: 3109～3116
  • DOI: 10.1016/j.jtha.2023.07.030
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Haemophilia and cardiovascular disease in Japan: Low incidence rates from ADVANCE Japan baseline data (2023)
  • 著者名/発表者名: Nagao Azusa、Chikasawa Yushi、Sawada Akihiro、Kanematsu Takeshi、Yamasaki Naoya、Takedani Hideyuki、Nojima Masanori、Fujii Teruhisa、Suzuki Nobuaki、Matsushita Tadashi、Higasa Satoshi、Amano Kagehiro、ADVANCE Japan Working Group
  • 雑誌名: Haemophilia 巻: 29 ページ: 1519～1528
  • DOI: 10.1111/hae.14876
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Cases of less‐than‐expected FVIII activity in previously treated patients during post‐marketing surveillance of N8‐GP (2023)
  • 著者名/発表者名: Oldenburg Johannes、Benson Gary、Chowdary Pratima、Halimeh Susan、Matsushita Tadashi、Norland Anne、Wahid Mohd Nawi、Nemes Laszlo
  • 雑誌名: Haemophilia 巻: 29 ページ: 1475～1482
  • DOI: 10.1111/hae.14864
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Clinical course and prognosis of patients with hepatocellular carcinoma and haemophilia (2023)
  • 著者名/発表者名: Matsuda Noritaka、Imai Norihiro、Yokoyama Shinya、Yamamoto Kenta、Ito Takanori、Ishizu Yoji、Honda Takashi、Okamoto Shuichi、Kanematsu Takeshi、Suzuki Nobuaki、Matsushita Tadashi、Ishigami Masatoshi、Kawashima Hiroki
  • 雑誌名: European Journal of Gastroenterology & Hepatology 巻: 35 ページ: 1211～1215
  • DOI: 10.1097/MEG.0000000000002628
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Use of nonacog beta pegol during surgery in persons with hemophilia B: a case series (2023)
  • 著者名/発表者名: Phua Chai W.、Matino Davide、Kuhnol CD.、Hegemann Inga、Matsushita Tadashi
  • 雑誌名: Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis 巻: 7 ページ: 102208～102208
  • DOI: 10.1016/j.rpth.2023.102208
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Phase 3 Trial of Concizumab in Hemophilia with Inhibitors (2023)
  • 著者名/発表者名: Matsushita Tadashi、Shapiro Amy、Abraham Aby、et al.
  • 雑誌名: New England Journal of Medicine 巻: 389 ページ: 783～794
  • DOI: 10.1056/NEJMoa2216455
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] 先天性・後天性血友病診療の最前線 (2023)
  • 著者名/発表者名: 松下正
  • 雑誌名: 日本内科学会雑誌 巻: 112 ページ: 2287-2294
  • オープンアクセス
• [学会発表] AKATSUKI 48-Week Interim Analysis: Emicizumab and Immune Tolerance Induction in People with Hemophilia A and Factor VIII Inhibitors (2023)
  • 著者名/発表者名: Tadashi Matsushita , Nobuaki Suzuki , Chiai Nagae , Azusa Nagao , Masahiko Ando , Yachiyo Kuwatsuka , Daisuke Nosaka , Yui Kyogoku , Tomomi Shimura , Keiji Nogami
  • 学会等名: ASH 2023
  • 国際学会
• [学会発表] 血栓止血分野における基礎研究の臨床応用 (2023)
  • 著者名/発表者名: 松下 正
  • 学会等名: 第85回血液学会学術集会
  • 招待講演
• [学会発表] 血液製剤の製造と輸血療法における品質改善 (2023)
  • 著者名/発表者名: 松下 正
  • 学会等名: 第47回日本血液事業学会総会
  • 招待講演
• [学会発表] Clauss-CWA法による異常フィブリノゲン血症スクリーニング 1年間の単施設前向き観察研究 (2023)
  • 著者名/発表者名: 鈴木 敦夫, 鈴木 伸明, 兼松 毅, 鈴木 奈瑠子, 岡本 修一, 田村 彰吾, 小嶋 哲人, 松下 正
  • 学会等名: 第24回日本検査血液学会学術集会
• [学会発表] 患者由来endothelial colony forming cell(ECFC)を用いたVWF欠損状態における血管新生能の評価 (2023)
  • 著者名/発表者名: 岡本 修一, 鈴木 伸明, 田村 彰吾, 兼松 毅, 鈴木 敦夫, 鈴木 奈瑠子, 川口 裕佳, 清井 仁, 小嶋 哲人, 松下 正, 早川 文彦
  • 学会等名: 第45回日本血栓止血学会学術集会
• [学会発表] 血友病患者における抗血小板療法の現状 当施設での経験 (2023)
  • 著者名/発表者名: 兼松 毅, 鈴木 伸明, 川口 裕佳, 鈴木 奈瑠子, 岡本 修一, 鈴木 敦夫, 田村 彰吾, 早川 文彦, 小嶋 哲人, 清井 仁, 松下 正
  • 学会等名: 第45回日本血栓止血学会学術集会
• [学会発表] ダモクトコグアルファペゴルの実臨床下での有効性と安全性を評価するHEM-POWR研究中間解析結果 (2023)
  • 著者名/発表者名: 松下 正, Reding Mark T., Alvarez Roman Maria Teresa, Sanabria Martin, Castaman Giancarlo, Janbain Maissaa, Meijer Karina, Schmidt Kathrin, Oldenburg Johannes
  • 学会等名: 第45回日本血栓止血学会学術集会
• [学会発表] エミシズマブ出血予防投与を開始した難治性後天性血友病Aの一例 AGEHA試験コホート2 (2023)
  • 著者名/発表者名: 鈴木 伸明, 兼松 毅, 岡本 修一, 鈴木 奈瑠子, 小林 亮太, 水野 成美, 尾崎 凌斗, 清井 仁, 松下 正, 嶋 緑倫
  • 学会等名: 第45回日本血栓止血学会学術集会
• [学会発表] マウス下大静脈結紮モデルを用いたアンチトロンビンレジスタンスに対する抗血栓療法の検討 (2023)
  • 著者名/発表者名: 徳丸 星奈, 鈴木 伸明, 田村 彰吾, 鈴木 敦夫, 兼松 毅, 岡本 修一, 鈴木 奈瑠子, 川口 裕佳, 小嶋 哲人, 早川 文彦, 松下 正
  • 学会等名: 第45回日本血栓止血学会学術集会
• [学会発表] フィブリノゲン製剤の定期補充療法が有効であった先天性無フィブリノゲン血症の1例 (2023)
  • 著者名/発表者名: 鈴木 奈瑠子, 鈴木 伸明, 鈴木 敦夫, 田村 彰吾, 川口 裕佳, 岡本 修一, 兼松 毅, 小嶋 哲人, 清井 仁, 松下 正
  • 学会等名: 第45回日本血栓止血学会学術集会
• [学会発表] 先天性無フィブリノゲン血症2症例に同定したFGA exon 4のホモ接合体欠失 (2023)
  • 著者名/発表者名: 田村 彰吾, 桂木 裕実, 鈴木 伸明, 岡本 修一, 藤井 渉, 鈴木 敦夫, 兼松 毅, 鈴木 奈瑠子, 能藤 日向子, 山崎 智司, 小嶋 哲人, 松下 正, 早川 文彦
  • 学会等名: 第45回日本血栓止血学会学術集会
• [学会発表] 成人血友病患者の合併症に関する多施設共同前向きコホート研究(ADVANCE Japan)ベースライン報告 (2023)
  • 著者名/発表者名: 山崎 尚也, 近澤 悠志, 兼松 毅, 野島 正寛, 竹谷 英之, 鈴木 伸明, 澤田 暁宏, 藤井 輝久, 天野 景裕, 日笠 聡, 松下 正, 長尾 梓
  • 学会等名: 第45回日本血栓止血学会学術集会
• [学会発表] 予防治療から切り替えた血友病A/Bを対象としたfitusiranの有効性/安全性を評価する第3相試験結果 (2023)
  • 著者名/発表者名: 松下 正, Kenet Gili, Nolan Beatrice, Zulfikar Bulent, Antmen Bulent, Kampmann Peter, You Chur-Woo, Vilchevska Kateryna, Bagor Catherine N., Sharif Azizan, Peyvandi Flora, Young Guy, Negrier Claude, Quan Ting, Poloskey Stacey, Sussebach Christian, Shammas Fadi, Andersson Shauna, Mei Baisong, Kavakli Kaan
  • 学会等名: 第45回日本血栓止血学会学術集会
• [学会発表] インヒビターを保有する血友病A/B患者におけるコンシズマブ第3相explorer7試験の主要解析結果 (2023)
  • 著者名/発表者名: 松下 正, ヒメネスジュステ・ビクター , アングチャイスクシリ・パンテプ , カスタマン・ジャンカルロ , セポ・カタリナ , ハニング・ジェスパー , ハルドヤコブセン・ソニヤ , マーラング・ジョニー , 野上 恵嗣, シャピロ・エイミー
  • 学会等名: 第45回日本血栓止血学会学術集会