| 研究課題/領域番号 |
23K07964
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| 研究機関 | 金沢大学 |
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研究代表者 |
岡田 寛史 金沢大学, 附属病院, 助教 (10735161)
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| 研究分担者 |
吉田 昌平 金沢大学, 附属病院, 助教 (30623657)
多田 隼人 金沢大学, 附属病院, 助教 (90623653)
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| 研究期間 (年度) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| キーワード | シトステロール血症 |
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| 研究実績の概要 |
シトステロール血症患者の網羅的遺伝子解析により抽出されたABCG5/ABCG8遺伝子におけるVUSに関する病原性評価を、ゲノム編集によりVUS配列を導入したヒト肝癌由来細胞株を用いて行う研究である。これらの細胞を用いた機能解析によるVUSの病原性評価と、In silico 解析を利用したものとの対比を行い、シトステロール血症患者におけるVUS の病原性評価スキームを構築することを目的としている。当研究室の先行する研究において、対象とするシトステロール血症患者のリクルート、DNA検体の採取、脂質代謝に関する検査血の確認については達成しており、DNA検体に対して網羅的遺伝子解析の結果、ABCG5/ABCG8における病原性を持つ異常遺伝子の候補遺伝子変異を抽出した。それら抽出された変異について、同じ塩基配列を持つようHepG2 に対して、CRISPR/Cas9 システムを用いてABCG5 およびABCG8 遺伝子をノックアウトし、単ノックアウトモデル(HepG2Abcg5-Abcg8+, HepG2Abcg5+Abcg8-)および二重ノックアウトモデル(HepG2Abcg5-Abcg8-)を作製する予定とし、ゲノム編集を行っている。しかしながら、HepG2細胞株に対するゲノム編集は、サンガー法によるDNA解析により遺伝子修正の確認を行っているところであるが、現在のところ未達成である。また、コレステロール排出活性試験については既報を参考として行う予定としており、条件検討を行なっている状況である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
進捗が遅延している原因としては、正確なゲノム編集が未達成であることが挙げられ、以降引き続いて行う予定である実験に進むことができないためやや遅れている状態と考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
遺伝子解析の結果抽出された変異について、同じ塩基配列を持つようHepG2 に対してはprime editing 法を用いてゲノム編集を行っているが、prime editing 法によるゲノム編集については、標的とする塩基配列を認識するpegRNA (prime editing guie)の設計がゲノム編集の際に重要となっており、RNAの設計方法を見直す必要がある。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
前述の如くゲノム編集に時間を要しており、ゲノム編集後の実験に関わる費用が少なかったことと、国内の学会での発表の機会が少なく、海外学会での発表の機会がなかったため、旅費として支出を予定していた費用に関する支出が無かったたことが理由として挙げられる。次年度は遺伝子編集後のノックアウトモデルの作製を確認、これらのモデルに対するコレステロール排出活性試験を含む機能解析を行う予定としている。遺伝子解析の結果、抽出された変異について、同じ塩基配列を持つようHepG2 に対してprime editing 法を用いてゲノム編集を行い、変異導入モデルを作製する予定であり、これらの実験に使用する試薬購入費に使用する予定である。
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