2023 年度実施状況報告書

難治性尿路上皮癌におけるマクロファージの不均一性と末梢血単核球に着目した基礎研究

研究課題

研究課題/領域番号	23K08786
研究機関	慶應義塾大学
研究代表者	北岡壮太郎慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (90936387)
研究分担者	森田伸也慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (10365364) 茂田啓介慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 訪問研究員 (10649875) 松本一宏慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (80366153)
研究期間 (年度)	2023-04-01 – 2026-03-31
キーワード	CD204 / CD8 / FGFR3 / Immune microenvironment / UTUC
研究実績の概要	研究課題の一つである腫瘍関連マクロファージ(TAM)に規定される免疫微小環境の把握をするため、当教室で保有する上部尿路上皮癌検体214例に対して、着目する分子マーカーで免疫組織学染色を行い、検討を行った。まず各臨床組織から病理学的に腫瘍中心部(Center of tumor: CT)・腫瘍辺縁部(Invasive margin: IM)を抽出することで、腫瘍内不均一性を克服する組織マイクロアレイ(TAM)を作成した。これを使用し、FGFR3, CD4/8/68/163/204, PDL1抗体を使用した免疫組織学染色を行い、各種免疫分子マーカーの発現と分布を確認した。この結果と臨床経過との統合を行い、予後やペムブロリズマブの奏効率との関連を解析している。現時点で、既報と同様に本臨床検体でもFGFR3が低発現の群では予後が不良であることがわかっている。しかしながらこの予後不良群の中にもペムブロリズマブへの感受性が良好な症例が含まれており、CD8が高発現群およびCD204低発現群に多いことが解析により判明した。これはTAMがT細胞性の癌免疫機構を抑制しているという知見を反映した結果であり、またCD8，CD204が免疫チェックポイント阻害薬の奏効率や予後と関連する有用なバイオマーカーとなりうることを示している。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由本研究の目的は、TAMが癌微小環境並びに免疫微小環境に及ぼす影響を明らかにすること、またそれにより免疫関連新規バイオマーカーならびに新規治療標的を同定することである。今回豊富な臨床検体を用いたTMAが作成できたことで、TAMに関連するバイオマーカーと癌微小環境および予後や免疫チェックポイント阻害薬の奏効率との関連を解析できる土台が整備されたと考える。解析はまだ未完であるが、CD8およびCD204が予後と関連しており、今後TAMが癌微小環境の構築や免疫チェックポイント阻害薬耐性に関わるということを裏付けられると考えている。また、マウスを用いた新たなヒト癌免疫マウスモデルの作成も目指している。in vivoにヒト同様の癌免疫微小環境を再現し、TAMのもつ働きを解明する足がかりとなると考えている。
今後の研究の推進方策	CD8, CD204の組織中の発現量をバイオマーカーとして用いることは簡便さに欠けるため、これらと関連するより有用なサロゲートマーカーとして、末梢血中の単球数および好中球リンパ球比に着目している。解析を進め、これらのマーカーと臨床成績との関連を実証する予定である。また示された臨床検体での研究成果をin vivoで再現するためヒト癌免疫マウスモデルを確立することを検討している。最先端の流体力学に基づく血中からの循環腫瘍細胞(CTC)濃縮システムを駆使して尿路上皮癌患者からリアルタイムにCTCを回収し、末梢血単核球との相関関係を検証する。倫理委員会(20180354)の承認後、すでにUC患者の末梢血をClear Cell FXシステムで回収し、CTCと末梢血単核球の単離を行ってサンプルを凍結保存している。このCTCと単核球に対し、単一細胞解析(シングルセル解析)を行う予定である。その後、単離したCTCを癌細胞として、末梢血中に単離した免疫細胞とともに免疫不全マウスに移植し、マウスにヒトの免疫系と癌微小環境を再構築したハイブリッドモデルを作成する。 Liquid Biopsy法で回収する免疫細胞とCTCはどちらも同一患者から採取しているため、他修飾による非生着率を最小限に抑えられるという利点がある。本研究におけるハイブリッドモデルの作成により、末梢血単球が癌組織内でどのようにTAMに変貌を遂げるのか、また組織内TAMがヒト免疫微小環境にどう影響するのかをマウス体内を場とした完全再現が可能となる。
次年度使用額が生じた理由	2023年度は効率の良い物品調達を心掛け、当初より少額での購入ができた。発生した残額については、CTC回収後の3次元培養液やプレートといった消耗品購入や、CTCシングルセル解析にNGS解析費用に使用する。また、マウスを使用したin vivoの実験も予定しているため、その購入費、飼育料にも使用する。