| 研究課題/領域番号 |
23K08935
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
岸本 曜 京都大学, 医学研究科, 准教授 (80700517)
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| 研究分担者 |
大西 弘恵 京都大学, 医学研究科, 特定助教 (50397634)
河合 良隆 京都大学, 医学研究科, 助教 (50862223)
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| 研究期間 (年度) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| キーワード | 声帯 / 線維化 / マクロファージ / 線維芽細胞 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、炎症性マクロファージの遊走抑制、修復性マクロファージへの分化誘導が、声帯創傷治癒過程においてそれぞれどのような効果を有するかを検討することを目的としている。今年度は、共培養系を用いた実験系を確立し、マクロファージおよび声帯線維芽細胞の相互作用を明らかとするため、まず、臨床声帯粘膜検体からの細胞株の樹立を計画した。
酵素処理（コラゲナーゼとディスパーゼ）により声帯粘膜検体から細胞を単離した。次に、CD271(p75 NGF受容体)抗体を用いた細胞分離用磁気ビーズ試薬EasySepで、ポジ（声帯上皮細胞）/ネガ（声帯線維芽細胞）細胞を分離回収した。１回継代した細胞を、E-cadherin抗体とCollagen1a1抗体で組織学的評価した後に、凍結保存した。
また、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素hTERTが挿入されたプラスミドを、ゲノム組み込み可能なプラスミドPiggyBacトランスポゾンベクターにIn-fusionを用いてクローニングした。得られたコロニーはPCRの後にサンガーシーケンス法で挿入部位の配列を確認した後に、大量培養してプラスミドを精製・回収した。
今後は、得られたプラスミドとSuper PiggyBacトランスポゼース発現ベクターをLonza電気穿孔法で細胞導入した後に、G418によるセレクションを行い、残ったコロニーのゲノムにhTERTが挿入されていることをシーケンシングするとともに、数回継代培養して増殖低下がないことを確認した後に、最終的に安定発現細胞株を樹立する予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
臨床検体からの初代培養において、コンタミを生じ、対応時時間を要したため、やや遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
安定発現細胞株を樹立した後、共培養系を用いた実験系を確立し、マクロファージおよび声帯線維芽細胞の相互作用を明らかとする。
また、in vitroの実験に並行して、in vivoの実験も進めていく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究に遅れが生じたため、次年度使用額が生じた。予定通りの実験を次年度以降で行うために使用する予定である。
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