ハイブリッド培養による生理機能を有する網膜再生と薬物評価／新規移植用iPS細胞作製

2023 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 23K09017
• 研究機関: 藤田医科大学
• 研究代表者: 山本 直樹 藤田医科大学, 橋渡し研究統括本部 橋渡し研究シーズ探索センター バイオリソース室, 特任教授 (00267957)
• 研究分担者: 平松 範子 藤田医科大学, バイオリソース室, 技術員 (10802209) ; 加藤 由布 藤田医科大学, バイオリソース室, 技術員 (50773412) ; 大熊 真人 藤田医科大学, 医学部, 講師 (50329710) ; 長井 紀章 近畿大学, 薬学部, 教授 (90411579)
• 研究期間 (年度): 2023-04-01 – 2026-03-31
• キーワード: 網膜再生 / 再生医療 / ハイブリッド培養 / iPS細胞 / 薬物評価

研究実績の概要

本研究では、同一組成培地のまま細胞間相互作用による改変二次元接着培養(改変SEAM法)と三次元浮遊培養法を組み合わせたハイブリッド培養法と従来のStep by Stepで培地の組成や培養環境を変化させるSFEBq法とを比較して、三次元網膜の形態やパッチクランプ法による電気生理学的機能を指標とした網膜視部の再生を評価することを目的としている。
今年度は、改変二次元接着培養において、細胞の相互間作用による分化によって層構造を形成しているため、細胞間結合が重要な役割を果たす。従って細胞間結合を破壊する酵素等を使用せずに培養ディッシュから細胞集団を剥離し、三次元培養へと移行させる必要がある。現時点において、温度応答性ポリマーではなく、ディスパーゼを使用することで、細胞間接着を維持したまま、培養ディッシュからコロニーを剥離させる手法を開発し、細胞間結合を維持した状態での継代に成功している。今後の電気生理学的機能評価のためには、コロニーの同一層における細胞集団をもう少し細かく分散できる条件を検討する必要があると考えている。
一方、改変二次元接着培養にて接着培養をした際、iPS細胞から分化したコロニー中心部に形成される網膜神経様細胞集団（1st/2nd zoneの細胞集団）を用いて、この細胞集団の形成・維持・成熟に必要な培養条件を探索し、高率的な培養条件を確立した。電気生理学的な神経細胞としての機能を調査するため、パッチクランプ法で解析できる細胞培養条件の確立、さらにMED64システムを使用した細胞集団の検査法に適した細胞培養条件の検証を行った。さらに網膜神経様細胞に対して導入予定の発現制御可能な不死化遺伝子ベクターの改良構築を行い、今後、神経前駆細胞の状態で発現制御可能な不死化遺伝子を導入することで、三次元網膜モデルの構築を進めていく。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

2023年度に予定していた同一組成培地のまま細胞間相互作用による改変二次元接着培養(改変SEAM法)と三次元浮遊培養法を組み合わせたハイブリッドの培養法と従来のStep by Stepで培地の組成や培養環境を変化させるSFEBq法との比較、電気生理学的検索法の細胞培養条件の検証、および不死化遺伝子ベクター改良について、予定どおり進捗しているため。

今後の研究の推進方策

改変二次元接着培養による網膜神経様細胞集団の分離を行うこと、電気生理学的な機能性評価、網膜神経様細胞集団の不死化遺伝子ベクター導入による細胞株の作製、および三次元網膜再生モデルの作製を検討し、薬物送達の評価系を樹立していく。さらにヒトへの移植応用をめざした新しい成人ヒト由来iPS細胞の開発と検証をさらに展開していく。

次年度使用額が生じた理由

不死化ベクターの合成を外注したところ、年度内での納品が間に合わないことが分かったため、2024年度になってから改めて購入することとした。
大学の研究施設の改組のため、大学内での引っ越しをすることとなり、2023年11月から2024年1月までの期間、実験を推進することができなかった。

備考

第62回日本白内障学会総会・第49回水晶体研究会を開催（2023.7.21-23）
https://jscr62.org/outline.html

研究成果

• [国際共同研究] University of Auckland/New Zealand Eye Center/Department of Physiology(ニュージーランド)
  • 国名: ニュージーランド
  • 外国機関名: University of Auckland/New Zealand Eye Center/Department of Physiology
• [雑誌論文] A novel cell source for therapy of knee osteoarthritis using atelocollagen microsphere-adhered adipose-derived stem cells: Impact of synovial fluid exposure on cell activity. (2024)
  • 著者名/発表者名: Sakamoto T, Fuku A, Horie T, Kitajima H, Nakamura Y, Tanida I, Sunami H, Hirata H, Tachi Y, Iida Y, Yamada S, Yamamoto N, Shimizu Y, Ishigaki Y, Ichiseki T, Kaneuji A, Osawa S, Kawahara N.
  • 雑誌名: Regen Ther. 巻: 27 ページ: 408-418
  • DOI: 10.1016/j.reth.2024.04.010.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Development of an Eye Irritation Test Method Using an In-House Fabrication of a Reconstructed Human Cornea-like Epithelium Model for Eye Hazard Identification. (2024)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto N, Hiramatsu N, Kato Y, Sato A, Kojima H.
  • 雑誌名: Bioengineering (Basel). 巻: 11 ページ: 302
  • DOI: 10.3390/bioengineering11040302.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Lens capsule pathological characteristics in cases of intraocular lens dislocation with atopic dermatitis. (2024)
  • 著者名/発表者名: Komatsu K, Masuda Y, Iwauchi A, Kubota H, Iida M, Ichihara K, Iwamoto M, Kawai K, Yamamoto N, Shimoda M, Nakano T.
  • 雑誌名: J Cataract Refract Surg. 巻: Epub ahead of print. ページ: .
  • DOI: 10.1097/j.jcrs.0000000000001413.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Optical Biopsies Using Probe-Based Confocal Laser Endomicroscopy for Autoimmune Pulmonary Alveolar Proteinosis. (2024)
  • 著者名/発表者名: Okamura T, Morikawa S, Horiguchi T, Yamatsuta K, Watanabe T, Ikeda A, Maeda Y, Ina T, Takahashi H, Moriya R, Goto Y, Isogai S, Yamamoto N, Okachi S, Hashimoto N, Imaizumi K.
  • 雑誌名: Respiration. 巻: 103 ページ: 171-176
  • DOI: 10.1159/000535992.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Piezo1 channel causes lens sclerosis via transglutaminase 2 activation. (2023)
  • 著者名/発表者名: Doki Y, Nakazawa Y, Sukegawa M, Petrova RS, Ishida Y, Endo S, Nagai N, Yamamoto N, Funakoshi-Tago M, Donaldson PJ.
  • 雑誌名: Exp Eye Res. 巻: 237 ページ: 109719
  • DOI: 10.1016/j.exer.2023.109719.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Aquaporins contribute to vacuoles formation in Nile grass type II diabetic rats. (2023)
  • 著者名/発表者名: Aihara K, Nakazawa Y, Takeda S, Hatsusaka N, Onouchi T, Hiramatsu N, Nagata M, Nagai N, Funakoshi-Tago M, Yamamoto N, Sasaki H.
  • 雑誌名: Med Mol Morphol. 巻: 56 ページ: 274-287
  • DOI: 10.1007/s00795-023-00365-w.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Recovery from indomethacin-induced gastrointestinal bleeding by treatment with teprenone. (2023)
  • 著者名/発表者名: Deguchi S, Iwakami A, Tujigiwa M, Otake H, Mano Y, Yamamoto N, Nakazawa Y, Misra M, Nagai N.
  • 雑誌名: J Pharm Health Care Sci. 巻: 9 ページ: 44
  • DOI: 10.1186/s40780-023-00312-y.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Therapeutic Effects of Hydrogel Formulations Incorporating Troxipide Nanoparticles on Oral Mucositis in Hamsters. (2023)
  • 著者名/発表者名: Kadowaki R, Ogata F, Nishida M, Komatsu M, Otake H, Nakazawa Y, Yamamoto N, Kawasaki N, Nagai N.
  • 雑誌名: Drug Des Devel Ther. 巻: 17 ページ: 3349-3361
  • DOI: 10.2147/DDDT.S433776.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Comparison of INTREPID balanced and hybrid tips on anterior capsule rupture in ex vivo porcine eyes. (2023)
  • 著者名/発表者名: Ichikawa K, Tanaka Y, Tokiwa S, Naito A, Hidaka Y, Ichikawa R, Ichikawa K, Yamamoto N.
  • 雑誌名: PLoS One. 巻: 18 ページ: e0290657
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0290657.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Flexural and Cell Adhesion Characteristic of Phakic Implantable Lenses. (2023)
  • 著者名/発表者名: Ichikawa K, Ichikawa K, Yamamoto N, Horai R.
  • 雑誌名: Medicina (Kaunas). 巻: 59 ページ: 1282
  • DOI: 10.3390/medicina59071282.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Hesperetin treatment attenuates glycation of lens proteins and advanced-glycation end products generation. (2023)
  • 著者名/発表者名: Doki Y, Nakazawa Y, Morishita N, Endo S, Nagai N, Yamamoto N, Tamura H, Funakoshi-Tago M.
  • 雑誌名: Mol Med Rep. 巻: 27 ページ: 103
  • DOI: 10.3892/mmr.2023.12990.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Synovial Fluid Derived from Human Knee Osteoarthritis Increases the Viability of Human Adipose-Derived Stem Cells through Upregulation of FOSL1. (2023)
  • 著者名/発表者名: Kitajima H, Sakamoto T, Horie T, Kuwano A, Fuku A, Taki Y, Nakamura Y, Tanida I, Sunami H, Hirata H, Tachi Y, Yamamoto N, Iida Y, Ishigaki Y, Yamada S, Shimodaira S, Shimizu Y, Ichiseki T, Kaneuji A, Osawa S, Kawahara N.
  • 雑誌名: Cells 巻: 12 ページ: 330
  • DOI: 10.3390/cells12020330.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Function of mitochondrial cytochrome-c oxidase is enhanced in human lens epithelial cells at high temperatures.. (2023)
  • 著者名/発表者名: Takeda S, Yamamoto N, Nagai N, Hiramatsu N, Deguchi S, Hatsusaka N, Kubo E, Sasaki H.
  • 雑誌名: Mol Med Rep. 巻: 27 ページ: 19
  • DOI: 10.3892/mmr.2022.12906.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] 基礎研究者からみた水晶体・白内障研究と治療への期待 (2023)
  • 著者名/発表者名: 山本直樹
  • 雑誌名: 日本白内障学会誌 巻: 35 ページ: 1
  • DOI: 10.14938/cataract.35-001
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] 【総説】眼科領域（視覚系）の再生医療研究アップデート (2023)
  • 著者名/発表者名: 山本直樹
  • 雑誌名: 日本白内障学会誌 巻: 35 ページ: 37-46
  • DOI: 10.14938/cataract.35-007
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] 水晶体の再生医療の可能性 (2023)
  • 著者名/発表者名: 山本直樹
  • 雑誌名: 日本白内障学会誌 巻: 35 ページ: 77-79
  • DOI: 10.14938/cataract.35-019
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Promotional Effect of Minoxidil Nanoparticles on Hair Growth in C57BL/6 Mice (2023)
  • 著者名/発表者名: Noriaki Nagai, Yoshihiro Oaku, Akinari Abe, Yajima Yuya, Fuka Sasaki, Chika Kubota, Sorato Shiroyama, Naoki Yamamoto
  • 学会等名: The Federation of Asian Pharmaceutical Associations (FAPA)
  • 国際学会
• [学会発表] 老視予防を目指して：亜セレン酸ナトリウム投与に伴う水晶体の硬化とその評価法の提案 (2023)
  • 著者名/発表者名: 久保田ちか、門脇玲太、浅井拓己、大竹裕子、中澤洋介、山本直樹、長井紀章
  • 学会等名: 第33回日本医療薬学会年会
• [学会発表] 糖尿病によるアクアポリン0の発現と水晶体混濁との関係 (2023)
  • 著者名/発表者名: 武田峻、相原夏奈、中澤洋介、山本直樹、初坂奈津子、水戸毅、久保江理、佐々木洋
  • 学会等名: 第127回日本眼科学会総会
• [学会発表] 糖尿病性白内障Vacuoles形成へのアクアポリンやコネキシンの寄与 (2023)
  • 著者名/発表者名: 相原夏奈、中澤洋介、武田峻、初坂奈津子、尾之内高慶、山本直樹、佐々木洋、多胡めぐみ
  • 学会等名: 第55回日本臨床分子形態学会総会・学術集会
• [学会発表] ピノレキシン点眼液は亜セレン酸ナトリウム誘発水晶体物性変化を改善する (2023)
  • 著者名/発表者名: 門脇玲太、浅井拓己、出口粧央里、大竹裕子、中澤洋介、山本直樹、長井紀章
  • 学会等名: 第62回日本白内障学会総会・第49回水晶体研究会
• [学会発表] 水晶体におけるPiezoチャネルの局在解析 (2023)
  • 著者名/発表者名: 中澤洋介、土岐友理、助川美優、Petrova Rosica、山本直樹、Donaldson Paul、多胡めぐみ
  • 学会等名: 第62回日本白内障学会総会・第49回水晶体研究会
• [備考] 藤田医科大学 教育・研究業績
  • URL: https://www.fujita-hu.ac.jp/achievements/index.php?action=pages_view_main&active_action=cvclient_view_main_init&cvid=naoki_yamamoto&display_type=cv&block_id=620#_620
• [備考] Researchmap
  • URL: https://researchmap.jp/naoki_yamamoto
• [備考] 第62回日本白内障学会総会・第49回水晶体研究会 大会長
  • URL: https://jscr62.org/outline.html
• [産業財産権] がん細胞の培養用および／または保存用の培地、がん細胞の初代培養方法 、がん細胞の継代培養方法およびがん細胞の保存方法 (2024)
  • 発明者名: 山本直樹、原（平松）範子、今泉和良、近藤征史、星川康
  • 権利者名: 学校法人藤田学園
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 特願2024-000352