接合上皮発現タンパク質と唾液エクソソームの歯周病診断マーカーとしての役割の解明

2023 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 23K09173
• 研究機関: 日本大学
• 研究代表者: 小方 頼昌 日本大学, 松戸歯学部, 教授 (90204065)
• 研究分担者: 中山 洋平 日本大学, 松戸歯学部, 准教授 (30434088) ; 高井 英樹 日本大学, 松戸歯学部, 准教授 (30453898)
• 研究期間 (年度): 2023-04-01 – 2026-03-31
• キーワード: 接合上皮 / エクソソーム / 唾液 / 歯周病 / 診断マーカー / アメロチン / ODAM / FDC-SP

研究実績の概要

慢性歯周炎患者で、歯間部のCALが5mm以上、PDは6 mm以上、エックス線上の骨吸収が歯根長の1/3超える30人の患者から歯周基本治療前後に歯周病検査と唾液採取を行い、唾液エクソソームを精製した。慢性歯周炎患者の治療前のPD、CAL、BOPおよびPISAは健常者に比べて優位に高値で、歯周基本治療後に有意に減少した。唾液エクソソーム内のC6およびHSP70タンパク質量の変化は、ウェスタンブロットのバンドの濃さで比較した。歯周炎患者でのC6タンパク質量は、歯周基本治療後に12名で増加、12名で減少、6名で変化が認められなかった。 歯周炎患者でのHSP70タンパク質量は、 歯周基本治療後に7名で増加、7名で減少、16 名で変化が認められなかった。C6タンパク質量が治療後に増加した患者群は、減少した患者群に比べ、歯周基本治療前のPISAの値が有意に高く、治療後に有意に減少したが、C6タンパク質量が治療後に増加した患者群では、歯周基本治療後のPISAの値も有意に高値であった。歯周基本治療後の平均PDは、歯周基本治療後にC6が減少した患者群よりもC6が増加した患者群の方が有意に高値であった。HSP70タンパク質量が治療後に増加した患者群は、変化しなかった患者群と比べ、歯周基本治療前のPD、BOP、PISAおよび歯周基本治後のPD、CAL、PISAが有意に高値であった。歯周基本治療後にHSP70タンパク質量が減少した患者群は、変化しなかった患者群と比べ、有意に高いBOPを示し。以上の結果から、歯周基本治療後に唾液エクソソーム中のC6およびHSP70タンパク質量が増加した患者群では、歯周組織の炎症が強く、歯周基本治療の効果が出づらいと考えられた。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

歯周治療を適切に行うためには、正確な歯周病検査の結果とエックス線での歯槽骨吸収の程度を基に診断し、治療計画を立案して治療を進めることが必要である。歯周病検査の中で、特にPD測定は、測定者のスキルと経験に左右される。さらに、歯周病検査の結果のみから、歯周病の活動度や治療成果及びの予後のを予測することは困難である。唾液の採取は容易であり、唾液エクソソーム中の成分が、難治性歯周炎の同定、治療結果の予測後、再評価の時期、メインテナンス間隔等の決定に使用できるバイオマーカーとしての可能性を検討した。歯周炎患者の歯周基本治療前後に唾液を採取し、歯周病臨床パラメーターと唾液エクソソーム中のC6およびHSP70 の変化を比較したところ、C6およびHSP70タンパク質量が歯周基本治療後に増加した患者群では、歯周基本治療前後でPISAの値が有意に高かった。現在、唾液中のヘモグロビン量や乳酸脱水素酵素活性、歯周病原菌酵素活性等が、歯科健診での歯周病スクリーニングや歯科医院を受診する動機付けを目的に使用されているが、唾液エクソソーム中のC6、HSP70等のタンパク質やmiRNA量を検出することで，歯周病治療への反応が悪い難治性歯周炎患者のスクリーニングや治療成果及びの予後の判定に使用できる可能性が示唆された。

今後の研究の推進方策

今年度の研究は、エクソソーム研究がメインであったが、接合上皮特異的に発現するタンパク質であるアメロチン、ODAMおよびFDC-SPの転写制御についても研究を進める。これまでの研究において、上記3つのタンパク質は、上皮性付着への関与が示唆され、炎症性歯肉で発現が増加することが明らかとなっている。今後は、miRNA発現ベクターを導入した歯肉上皮細胞をTNF-α、IL-1βまたはIL-6で刺激し、炎症時の細胞環境を再現することで、炎症性歯肉で発現が増加するmiR-200bおよびmiR-223による遺伝子発現調節機構を解析し、炎症時の接合上皮における動態を解明したい。さらに本研究の成果を踏まえ、炎症環境が上記3タンパク質の遺伝子発現調節を介して、接合上皮のバリア機能に及ぼす影響についても考察を行い、歯周病発症のメカニズムを解き明かす一端としたい。

次年度使用額が生じた理由

これまでの研究は、エクソソーム研究がメインであったが、次年度は、接合上皮特異的に発現するタンパク質であるアメロチン、ODAMおよびFDC-SPの転写制御についても研究を進めるため、細胞にmiRNA発現ベクターを導入するためのリポフェクタミン、歯肉上皮細胞を培養するための細胞培養経費、TNF-α、IL-1βまたはIL-6で刺激するため、サイトカインを購入する経費等が必要である。炎症時の細胞環境を再現することで、炎症性歯肉で発現が増加するmiRNAによる遺伝子発現調節機構を解析し、炎症時の接合上皮における動態を解明したい。さらに、炎症環境が上記3タンパク質の遺伝子発現調節を介して、接合上皮のバリア機能に及ぼす影響についても考察を行う予定である。次年度使用額（5,476円）が生じた理由は、研究遂行に使用する試薬が予定よりも安価に購入できたためである。

研究成果

• [雑誌論文] Carbonate apatite increases gene expression of osterix and bone morphogenetic protein 2 in the alveolar ridge after socket grafting (2024)
  • 著者名/発表者名: Kitazawa T, Takai H, Kono T, Okada H, Ogata Y
  • 雑誌名: Journal of Oral Science 巻: 66(1) ページ: 15-19
  • DOI: 10.2334/josnusd.23-0220
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Identification of nutritional factors to evaluate periodontal clinical parameters in patients with systemic diseases (2023)
  • 著者名/発表者名: Nakayama Y, Tabe S, Yamaguchi A, Tsuruya Y, Kobayashi R, Oyama K, Kitano D, Kojima K, Kogawa R, Okumura Y, Ogihara J, Senpuku H, Ogata Y
  • 雑誌名: Nutrients 巻: 15(29 ページ: 365
  • DOI: 10.3390/nu15020365
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Utility of a haemoglobin test of gingival crevicular fluid: A multicentre, observational study (2023)
  • 著者名/発表者名: Ito H, Numabe Y, Hashimoto S, Sekino S, Murakashi E, Ishiguro H, Sasaki D, Yaegashi T, Takai H, Mezawa M, Ogata Y, Watanabe H, Izumi Y, Kido JI, Hiroshima Y, Nagata T. Ito H, Numabe Y, Hashimoto S, Sekino S, Murakashi E, Ishiguro H, Sasaki D, Yaegashi T, Takai H, Mezawa M, Ogata Y, et a.
  • 雑誌名: Oral Disases 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1111/odi.14536
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Changes in the components of salivary exosomes due to initial periodontal therapy (2023)
  • 著者名/発表者名: Yamaguchi A, Tsuruya Y, Igarashi K, Jin Z, Yamazaki-takai M. Takai H, Nakayama Y, Ogata Y
  • 雑誌名: Journal of Periodontal & Implant Science 巻: 53(1) ページ: e3
  • DOI: 10.5051/jpis.2203700185
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Impact of COVID-19 spread on visit intervals and clinical parameters for patients with periodontitis in supportive periodontal therapy: a retrospective study (2023)
  • 著者名/発表者名: Yamazaki-Takai M, Saito Y, Ito S, Ogihara-Takeda M, Katsumata T, Kobayashi R, Nakagawa S, Nishino T, Fukuoka N, Hosono K, Yamasaki M, Yamazaki Y, Tsuruya Y, Yamaguchi A, Ogata Y
  • 雑誌名: Journal of Periodontal & Implant Science 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.5051/jpis.2300620031
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Role of Macrophage Colony-Stimulating Factor for Staphylococcal Infection in the Oral Cavity (2023)
  • 著者名/発表者名: Senpuku H, Yoshimura K, Takai H, Maruoka Y, Yamashita E, Tominaga A, Ogata Y
  • 雑誌名: Journal of Clinical Medicine 巻: 12(18) ページ: 5825
  • DOI: 10.3390/jcm12185825
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Follicular dendritic cell-secreted protein遺伝子発現に対するinterferon-γの影響 (2023)
  • 著者名/発表者名: 五十嵐一馬，山口亜利彩，金振宇，高井瑞穂，高井英樹，中山洋平，小方賴昌
  • 学会等名: 第66回春季日本歯周病学会
• [学会発表] 歯周基本治療前後における唾液エクソソーム中の成分の変化 (2023)
  • 著者名/発表者名: 山口亜利彩，五十嵐一馬，金振宇，高井瑞穂，高井英樹，中山洋平，小方賴昌
  • 学会等名: 第66回春季日本歯周病学会
• [学会発表] IL-1β刺激により歯肉線維芽細胞から分泌されたエクソソーム中のmiRNAによる骨芽細胞関連転写因子の抑制 (2023)
  • 著者名/発表者名: 高井英樹，山口亜利彩，小方賴昌
  • 学会等名: 第66回春季日本歯周病学会
• [学会発表] TNF-αおよびIL-6による骨関連転写因子の抑制は Saos2骨芽細胞様細胞のアルカリホスファターゼ活性を抑制する (2023)
  • 著者名/発表者名: 北澤伊，高井英樹，小方賴昌
  • 学会等名: 第66回春季日本歯周病学会
• [学会発表] ヒト歯肉線維芽細胞のエクソソームにおけるマイクロＲＮＡ発現プロファイル (2023)
  • 著者名/発表者名: 山口亜利彩，五十嵐一馬、高井瑞穂，高井英樹，中山洋平，小方賴昌
  • 学会等名: 第66回秋季日本歯周病学会
• [学会発表] miR-200aによる歯肉線維細胞の骨芽様細胞への分化誘導 (2023)
  • 著者名/発表者名: 高井英樹，小方賴昌
  • 学会等名: 第66回秋季日本歯周病学会
• [学会発表] MiR-200b suppresses TNF-α-induced ODAM gene expression in human gingival epithelial cells (2023)
  • 著者名/発表者名: Zhenyu Jin, ArisaYamaguchi, Kazuma Igarashi, MizuhoYamazaki-Takai, Hideki Takai, Yohei Nakayama, Yorimasa Ogata
  • 学会等名: 第66回秋季日本歯周病学会
• [学会発表] エムドゲインゲルおよびリグロスによる歯周組織再生療法後の創傷治癒比較 (2023)
  • 著者名/発表者名: 中山洋平，田部進市，五十嵐一馬，守屋 叡，勝又 剛，小林 涼，中川就太，西野智子，福岡菜見子，細野恒太，山崎真依，山﨑陽祐，武田 萌，伊藤正一，齋藤由未，山口亜利彩，高井瑞穂，高井英樹，小方賴昌
  • 学会等名: 第66回秋季日本歯周病学会