2023 年度実施状況報告書

フタトゲチマダニの系統識別法の開発および系統間における病原体媒介能の検証

研究課題

研究課題/領域番号	23K14090
研究機関	北海道大学
研究代表者	尾針由真北海道大学, 人獣共通感染症国際共同研究所, 助教 (00847056)
研究期間 (年度)	2023-04-01 – 2026-03-31
キーワード	フタトゲチマダニ / 倍数性識別 / マイクロサテライトDNA
研究実績の概要	本研究では、倍数性の異なるフタトゲチマダニHaemaphysalis longicornisの識別方法を開発し、その系統間における病原体の媒介能力の差を検証することを目的としている。本年度は、2倍体で両性生殖により次世代を産生する系統と3倍体でメスのみが単為生殖により産卵する系統のフタトゲチマダニを識別する方法として、複数のマイクロサテライトDNA領域を用いた手法開発を試みた。開発段階で、これまではデータバンクに登録されているニュージーランド産フタトゲチマダニの卵塊から解読された全ゲノムデータを用いてマイクロサテライトDNA領域の探索およびプライマー設計を行ない、100,000領域以上が発見され200領域ほどについてPCRを行なったものの、系統間の識別に適した領域を見つけることができていなかった。このため、ニュージーランドと日本のフタトゲチマダニの間で、マイクロサテライトDNA領域が異なる可能性が考えられた。そこで、日本産フタトゲチマダニの全ゲノム解析を試みようとしたところ、日本で採集された個体に由来し実験室で継代維持されていた2倍体フタトゲチマダニの全ゲノムデータが公開された。そこで、新たにデータバンクから全ゲノムデータを取得してマイクロサテライトDNA領域の探索を再度実施し、120,000領域以上のマイクロサテライトDNA領域が検出された。今後は検出されたマイクロサテライトDNA領域を増幅できるプライマーを設計し、系統間を識別可能な領域を探索する予定である。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由これまで、データバンクに登録されているニュージーランド産フタトゲチマダニの卵塊から解読された全ゲノムデータを用いてマイクロサテライトDNA領域の探索およびプライマー設計を行ない、プライマーの運用試験に日本で採集されたフタトゲチマダニを用いていた。しかし、100,000領域以上を発見し200領域以上のPCRを試みたものの、系統間の識別を目的としたマイクロサテライト解析に有用な領域が発見できていなかった。この結果から、ニュージーランドと日本のフタトゲチマダニの間に遺伝的な違いがある可能性を考え、日本のフタトゲチマダニについて全ゲノム解析を試みようとしたところ、日本で採集された個体に由来し実験室で継代維持されていた2倍体フタトゲチマダニの全ゲノムデータが公開された。そこで、新たにデータを取得し3～5bpのモチーフ配列を対象としたマイクロサテライトDNA領域の探索を行なった。その結果、3 bpモチーフが8,536、4 bp モチーフが112,758、5 bpモチーフが911領域となり、合計122,205領域のマイクロサテライトDNA領域を検出することができた。ただしこの中には、同じ塩基が連続するモチーフも含まれているため、今後さらにフィルタリングを行ない、プライマーの設計および解析に有用な領域の探索を進めていく。また、手法開発後に用いる野外サンプルを確保するために北海道内においてサンプリングを行ない、100個体以上のフタトゲチマダニを採集した。
今後の研究の推進方策	本年度は、研究課題開始以前から発見済みだったマイクロサテライトDNA領域を対象としてプライマーを設計し、日本のフタトゲチマダニを用いて有用性の検証を実施したが、有用な領域およびプライマーは得られていない。そこで日本のフタトゲチマダニの全ゲノムデータからマイクロサテライト領域の探索を行なったところ、多数の領域が得られた。今後は、これらの領域についてプライマー設計を行ない、日本のフタトゲチマダニを用いて有用性を検証していく。また日本のフタトゲチマダニの全ゲノムデータを登録した研究者とは既に協力関係にあり、ゲノム取得に用いられたフタトゲチマダニの実験室株を用いた検証も可能である。さらに、in silicoの解析によりニュージーランドと日本から登録されてるフタトゲチマダニの全ゲノムデータの両方で発見されたマイクロサテライトDNA領域を絞り込むことで、日本だけでなく海外に生息するフタトゲチマダニについても解析可能な手法開発にも着手する予定である。また日本におけるフタトゲチマダニの系統間における分布の再検討およびマダニ媒介性感染症の病原体保有率を比較するために、日本各地でフタトゲチマダニを採集する予定である。本年度は、北海道においてサンプリングを行ない、フタトゲチマダニが採集できる地点を確保している。さらに採集したフタトゲチマダニについて、マイクロサテライトDNA解析を用いて系統間の識別を行ない、縮約ゲノム解析や全ゲノム関連解析を用いて系統間の病原体保有状況と遺伝的要因の特定を試みる。
次年度使用額が生じた理由	日本由来のフタトゲチマダニを用いたマイクロサテライトDNA領域の探索に必要だった全ゲノムシーケンスが、データベースに登録されたため実施不要になったことから、次年度使用額が生じた。生じた額は、次年度以降に予定されていた野外でのフタトゲチマダニのサンプリングに当てられ、今後も継続してく予定である。