| 研究課題/領域番号 |
23K14132
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| 研究機関 | 公益財団法人東京都医学総合研究所 |
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研究代表者 |
楊 其駿 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 研究員 (80792647)
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| 研究期間 (年度) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| キーワード | Claspin / stress / Heat shock / elf2 / Chk1 |
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| 研究実績の概要 |
Claspinは、DNA複製におけるフォーク進行と開始を促進する重要な複製因子として知られています。近年、私たちはClaspinの新たな役割を発見しました。それは、酸化ストレス、浸透圧ストレス、温度変化、細菌感染、低酸素、高グルコースなど、様々な生物学的ストレスに対する細胞応答に関与するということです。これらのストレスは、Chk1と呼ばれるキナーゼをClaspin依存的に活性化します。
私たちは、4つのeIF2aキナーゼ（PERK、GCN2、PKR、HRI）を欠損させたMEF細胞株を用いて、Claspin-Chk1活性化メカニズムをさらに調べました。その結果、GCN2とHRIの発現がClaspin-Chk1活性化に必須であること、eIF2aキナーゼがClaspin-Chk1の活性化状態の維持に必要であることが明らかになりました。これらの結果から、eIF2aキナーゼは、Claspin-Chk1活性化と細胞の熱ストレス応答に重要な役割を果たしていると考えられます。
私たちは、高温処理でClaspinのC末端に存在する5つのリン酸化サイトがリン酸化されることを質量分析によって確認しました。さらに、生化学的解析とキナーゼ阻害剤を用いて、これらのリン酸化サイトがGCN2とHRIによってリン酸化されることを検証しました。これらの結果から、ClaspinとeIF2aキナーゼの相互作用は、細胞の熱ストレス応答に重要な役割を果たしていると考えられます。さらに、2つのリン酸化サイト変異体細胞株を作製しました。この変異体細胞株は、今後の熱ストレスやその他の生物学的ストレスに対する細胞応答にどのように影響を与えるかを検証できます。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
熱ストレスは、eIF2αキナーゼのGCN2とHRIの発現によってChk1活性化が回復され、その活性化にはeIF2αキナーゼが必要であることが発見されました。eIF2αキナーゼは、Claspin-Chk1またはその活性化状態の維持に必要であることが示唆されました。さらに、ClaspinのC端の5つのリン酸化サイトがリン酸化されました。この5つのリン酸化サイトはGCN2とHRIによりリン酸化されました。ClaspinとeIF2αキナーゼの相互作用は、高温に対する細胞応答の役割が重要だと考えています。熱ストレスが誘導するClaspinのリン酸化を指標に、そのリン酸化部位を同定しました。高温により、ClaspinのC末端の5つのリン酸化部位がリン酸化されることが確認されました。これら5つのリン酸化部位のリン酸化は、生物情報学的手法により、GCN2とHRIが可能性のあるリン酸化酵素として予測されました。さらに、純化されたタンパク質を用いて、GCN2とHRIがClaspinのC末端の5つのリン酸化部位をリン酸化できることを確認しました。また、Claspinの5つのリン酸化部位を持つ変異体を安定に発現する細胞株を構築し、この細胞株を用いて、ClaspinのC末端の5つのリン酸化部位がChk1の活性化を促進できることが確認されました。ClaspinとeIF2αキナーゼの相互作用に関する高温に対する細胞応答の役割についての研究は順調に進行しています。
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| 今後の研究の推進方策 |
Claspinの5つのリン酸化部位を持つ変異体を安定に発現させる細胞株を用いて、関連キナーゼを同定し、それらの機能的意義を解析します。Claspinが高温に対する細胞応答のメカニズムを解析します。今後、私たちは作製した5つのリン酸化サイト変異体細胞株を利用して、その変異体が熱ストレスやその他の生物学的ストレスに対する細胞応答にどのように影響を与えるかを検証する予定です。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次年度は熱やさまざまなストレスに対して細胞がどのような反応をするのか解明するために、ウェスタンブロッティング用と質量分析用の抗体、実験や解析に必要な試薬、RNAとDNAのシーケンシング解析など、高額な経費が必要となります。それ故、その費用を来年度へ繰り越すことといたしました。
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