| 研究課題/領域番号 |
23K14308
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| 研究機関 | 兵庫医科大学 |
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研究代表者 |
佐久間 理香 兵庫医科大学, 医学部, 助教 (90780180)
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| 研究期間 (年度) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| キーワード | ペリサイト / pNrf2 / Protein Kinase C / 幹細胞化 / 脳梗塞 |
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| 研究実績の概要 |
iPCsに発現しているNrf2がリン酸化されているものであるかどうかを、抗pNrf2抗体及びpNrf2と交差しない抗Nrf2抗体を用いて検討した。正常脳ペリサイトよりもiPCsにおいて、pNrf2が核内に高発現している様子が見られた。また、Nrf2はiPCsにおいて、小胞体と思しき領域に強く発現していることが分かった。Western blottingの検討においても、pNrf2がiPCsにのみ発現していることが判明した。このpNrf2がProten Kinase Cによってリン酸化修飾を受けたものであるかどうかを、広域のPKC阻害剤（Gouml 6983）を1-50マイクロMの濃度を振って添加し、幹細胞マーカーの発現について検討したところ、50マイクロMの濃度においてiPCsのpNrf2のバンドが減少することが分かった。
そこで、iPCsに発現しているPKC isoformについてRT-PCRにて解析したところ、先にマイクロアレイ解析で判明していたPKCβだけでなくPKCδについても発現していることが判明した。そこで、PKCβ阻害剤（LY-333531）及びPKCδ阻害剤（Rottlerin）をiPCsに濃度を振って添加したところ、PKCδ阻害剤を5マイクロM添加した条件においてのみpNrf2のバンドが減少した。免疫染色においても、PKCδ阻害剤添加によりpNrf2の核内の発現が減少しており、Nrf2の発現が強くなっていることが判明した。また、nestin、Sox2といったiPCsに発現している幹細胞マーカーが減少していた。このことから、iPCsに発現しているNrf2はPKCδによるリン酸化修飾を受けており、幹細胞マーカーを調節していることが考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
iPCsで発現しているNrf2はPKCによってリン酸化されていることが判明し、仮説通りの結果を得られたが、iPCsにおいてPKCβだけではなくPKCδについても発現していたことが判明した。PKCβにはカルシウムイオン結合領域があるが、PKCδには存在していない。正常脳ペリサイトにカルシウムイオンイオノフォア、iPCsにカルシウムイオン阻害剤を添加してもnestinなどの幹細胞マーカーに変化がみられなかった。このことからもPKCβによる調節を受けていないことを裏付けていた。いずれにしても、iPCsに発現しているリン酸化Nrf2はPKCによる修飾であったという仮説は正しく、PKCδ阻害剤によってiPCsの幹細胞マーカーが減少している結果を得たことから、計画は概ね順調に進展していると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
脳梗塞モデルマウスにDMSO、PKCβ及びPKCδ阻害剤を腹腔内注射して梗塞巣内に現れるiPCsに変化がみられるかどうかを検討する。この動物実験計画書は既に「兵庫医科大学動物実験規程」に基づき動物実験委員会の承認を得ており（#23-100A）、現在研究を遂行している。PKCδ活性化剤については情報が乏しいが、PMA（12-O-Tetradecanoylphorbol 13-acetate）というPKC活性化剤が活性酸素に応答してPKCδを活性化させる報告がある。そこで、PMAを正常脳ペリサイトに添加し、幹細胞マーカーに変化がみられるのかどうかを検討する。
もし、PMAの投与で梗塞領域の変化がみられないようであれば、薬剤スクリーニングによるPKCδ活性化剤の選定を行い、正常脳ペリサイトに添加し幹細胞マーカーに変化が現れるのかどうかを検討する。そして、治療薬候補を脳梗塞モデルマウスに投与することで、脳梗塞後の症状が改善されるかどうかを各種行動試験（Open field test、ロータロッド試験など）により総合的に評価し、ペリサイト幹細胞化を利用した新規治療法の臨床応用を目指す。
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