2023 年度実施状況報告書

磁気ビーズによる口腔ピロリ菌の検出と乳酸菌、多価不飽和脂肪酸による感染予防の検索

研究課題

研究課題/領域番号	23K15997
研究機関	新潟大学
研究代表者	永田量子新潟大学, 医歯学総合病院, 医員 (40911748)
研究期間 (年度)	2023-04-01 – 2025-03-31
キーワード	Helicobacter pylori / Nested PCR / Immunomagnetic beads
研究実績の概要	本研究ではポリクローナル抗体結合磁気ビーズを用いて、口腔Helicobacter pylori (以下ピロリ菌)を検出する方法を確立し、口腔サンプルから分離できるか否かを検証する。 H. pylori IID3023株を培養し、OD600を5x10-1~10-7まで調整した。また、それらの菌液をStreptococcus mutans UA159懸濁液 (OD600 0.5) にそれぞれ混和した。抗体はAnti-Helicobacter pylori ab20459 (Abcam, Cambridge, England) を使用した。磁気ビーズはDynabeads M-280 Tosylactivated (Veritas, Tokyo, Japan) を用い、プロトコールに従って処理した。各濃度の菌液1mlに反応後回収したビーズを、培養及びNested PCRで回収率を確認した。結果、培養法ではいずれの濃度でも菌が回収されたが、濃度の低下とともに回収量は低下した。Nested PCRでの検出限界はOD600 5x10-5であった。混合菌液の検出限界はOD600 5x10-4であり、回収率の低下が確認された。以前の報告により、1st及び2nd PCRによる検出限界はそれぞれOD600 5x10-3、5x10-6である。培養法では全濃度でコロニーが確認されているが、口腔ピロリ菌が培養可能な状態で存在するか不明である。Nested PCRによる検出限界は5x10-5であり、混合菌液では回収率が低下する。口腔ピロリ菌は2nd PCRで検出できる濃度で存在し、磁気ビーズで回収できると証明することはできない。現在、使用する抗体の種類を増やし、抗体により検出率が異なることを確認している。抗体を混合することで、多様な形態で存在しうる口腔ピロリ菌の検出に対応可能か検証している。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由磁気ビーズの抗体付与及びサンプル回収において、効率の良い器具の詮索に時間がかかった。当初は、抗体も１種類のみ使用していたが、回収効率の向上のために３種類まで増やし、さらに混合することを決定し、それぞれの抗体の特性を見極めることに時間をかけてしまった。
今後の研究の推進方策	私達の以前の報告により、1st及び2nd PCRによる検出限界はそれぞれOD600 5x10-3、5x10-6である。培養法では全濃度でコロニーが確認されているが、口腔ピロリ菌が培養可能な状態で存在するか不明である。磁気ビーズにて回収したピロリ菌の、Nested PCRによる検出限界は5x10-5であり、混合菌液では回収率が低下する。口腔内にはさらに多種多様な細菌が存在するため、回収率はもっと低下する可能性がある。口腔ピロリ菌は2nd PCRで検出できる濃度で存在し、磁気ビーズで回収できると証明することはできない。現在、使用する抗体の種類を増やし、抗体により検出率が異なることを確認している。抗体を混合することで、多様な形態で存在しうる口腔ピロリ菌の検出に対応可能か検証している。
次年度使用額が生じた理由	他大学との共同研究費があり、科研費の使用量が減少した。本年度は、解析及び論文提出に使用する。