Low copy repeats組換えホットスポットのゲノム・エピゲノム基盤の解明

2023 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 23K18278
• 研究機関: 横浜市立大学
• 研究代表者: 水口 剛 横浜市立大学, 医学部, 准教授 (90404996)
• 研究期間 (年度): 2023-06-30 – 2025-03-31
• キーワード: Low copy repeats / ソトス症候群 / ロングリードシーケンス / DNAメチル化 / ゲノム高次構造

研究実績の概要

ソトス症候群におけるLow copy repeats (LCRs)を介したNSD1遺伝子領域の欠失の多くは父由来染色体から発生する事が報告されているが、この親由来の偏りの分子基盤は不明である。「父の染色体において欠失の誘因となる特徴的なゲノム構造、メチル化異常、ゲノム高次構造が存在するか」という仮説を検証するため下記の研究項目を実施した。
(1) 相決定：患者・両親（トリオ）由来のゲノムDNAを用いてロングリードシーケンスを実施した。Hiphaseを用いた相決定を行った（phase blockの平均240kb, Max 3.4Mb）。またread depthを用いたCNV解析により、これまでロングリードのStructural Variant解析で検出できなかった1Mbを超えるサイズのNSD1遺伝子を含む5q35領域の欠失を検出し父親由来の欠失を塩基レベルで確認することに成功した。
(2) LCRsの区別：平均リード長が10kbを超えるロングリードシーケンスを用いてもLCRs領域の解析は困難を極める。Monarch HMW DNA Extraction Kitにより抽出した高分子量ゲノムDNAをinputとしてultra-long DNAシークエンス (ONT PromethION)を実施した。通常のプロトコールに比較して長いリード長を達成したが[リード長 平均42 kb, Max 822 kb (ultra-long) vs 平均15 Kb, Max411 kb (通常解析の平均)]、一方で出力が通常の1/3以下に減少した[30 Gb (ultra-long) vs 104 Gb (通常解析の平均)] 。
(3) DNAメチル化：（１）（２）で得られたデータについてJasmine, Guppyを使用したメチル化検出を行い、2本の染色体を区別したDNAメチル化解析が可能となった。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

当初の計画通り、ソトス症候群の5q35領域欠失症例についてトリオベース（患者・両親）でロングリードシーケンスを行い、相決定・DNAメチル化・LCRs領域解析のワークフローを確立できた。この解析により、これまで塩基レベルで解析が困難とされたLCRs領域を含む5q35領域についてハプロタイプを区別したゲノム・DNAメチル化解析が可能であることが確認できた。当初LCRs領域を十分に長いリード長で解析するために、ultra-long DNAシークエンスが必要ではないかと考えていたが、高分子量DNAのハンドリングが容易ではなく、再現性をもって解析に十分な出力（30×カバレッジ）得ることが難しいことが分かった。更にultra-long DNAシークエンスと通常プロトコールの解析結果を比較したところ、5q35領域（LCRs含む）の解析には通常プロトコールで十分であることが明らかにできた。一方で検証に時間がかかったため、想定解析数を下回っている。

今後の研究の推進方策

健康な両親を含めたトリオ検体のDNAと細胞株の樹立を継続し、トリオベースのロングリードシークエンスを行う。5q35領域（LCRs含む）の解析には通常プロトコールで十分であることがわかったので、ultra-long DNAシークエンスではなく通常プロトコールを採用することにする。得られたデータについて1年目に構築した解析系を用いてゲノム構造・DNAメチル化の差異を検討する。また2年目以降に計画していたゲノム高次構造解析系についても構築を試みる。

次年度使用額が生じた理由

当初、ultra-long DNAシークエンスが必要ではないかと考えていたため、高分子量DNAの抽出やultra-long DNAシークエンス解析の予備実験に時間を要し、想定解析数を下回ったことから実験試薬の購入に未使用額が生じた。予備実験の結果から通常プロトコールを採用することにしたので、当初の見込み額と執行額は異なったが、研究計画に変更はなく、研究の進捗状況を鑑みて必要に応じた物品購入の執行を行う予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Whole-exome sequencing reveals causative genetic variants for several overgrowth syndromes in molecularly negative Beckwith-Wiedemann spectrum (2024)
  • 著者名/発表者名: Higashimoto K., Sun F., Imagawa E., Saida K., Miyake N., Hara S., Yatsuki H., Kubiura-Ichimaru M., Fujita A., Mizuguchi T., Matsumoto N. and Soejima H.
  • 雑誌名: J Med Genet 巻: NA ページ: NA
  • DOI: 10.1136/jmg-2023-109621
  • 査読あり
• [雑誌論文] Novel compound heterozygous ABCA2 variants cause IDPOGSA, a variable phenotypic syndrome with intellectual disability (2024)
  • 著者名/発表者名: Inoue Y., Tsuchida N., Kim C. A., de Oliveira Stephan B., Castro M. A. A., Honjo R. S., Bertola D. R., Uchiyama Y., Hamanaka K., Fujita A., Koshimizu E., Misawa K., Miyatake S., Mizuguchi T. and Matsumoto N.
  • 雑誌名: J Hum Genet 巻: 69 ページ: 163-167
  • DOI: 10.1038/s10038-024-01219-8
  • 査読あり
• [雑誌論文] Detection of hidden intronic DDC variant in aromatic L-amino acid decarboxylase deficiency by adaptive sampling (2024)
  • 著者名/発表者名: Koshimizu E., Kato M., Misawa K., Uchiyama Y., Tsuchida N., Hamanaka K., Fujita A., Mizuguchi T., Miyatake S. and Matsumoto N.
  • 雑誌名: J Hum Genet 巻: 69 ページ: 153-157
  • DOI: 10.1038/s10038-023-01217-2
  • 査読あり
• [雑誌論文] Case report: Neuronal intranuclear inclusion disease initially mimicking reversible cerebral vasoconstriction syndrome: serial neuroimaging findings during an 11-year follow-up (2024)
  • 著者名/発表者名: Lee G. H., Jung E., Jung N. Y., Mizuguchi T., Matsumoto N. and Kim E. J.
  • 雑誌名: Front Neurol 巻: 15 ページ: 1347646
  • DOI: 10.3389/fneur.2024.1347646
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Abnormal axonal development and severe epileptic phenotype in Dynamin-1 (DNM1) encephalopathy (2024)
  • 著者名/発表者名: Matsubara K., Kuki I., Ishioka R., Yamada N., Fukuoka M., Inoue T., Nukui M., Okamoto N., Mizuguchi T., Matsumoto N. and Okazaki S.
  • 雑誌名: Epileptic Disord 巻: 26 ページ: 139-143
  • DOI: 10.1002/epd2.20181
  • 査読あり
• [雑誌論文] A female case of L1 syndrome that may have developed due to skewed X inactivation (2024)
  • 著者名/発表者名: Mori T., Nakano M., Tayama T., Goji A., Toda Y., Kameyama S., Mizuguchi T., Urushihara M. and Matsumoto N.
  • 雑誌名: Brain Dev 巻: NA ページ: NA
  • DOI: 10.1016/j.braindev.2024.03.001
  • 査読あり
• [雑誌論文] A heterozygous germline deletion within USP8 causes severe neurodevelopmental delay with multiorgan abnormalities (2024)
  • 著者名/発表者名: Sakamoto M., Kurosawa K., Tanoue K., Iwama K., Ishida F., Watanabe Y., Okamoto N., Tsuchida N., Uchiyama Y., Koshimizu E., Fujita A., Misawa K., Miyatake S., Mizuguchi T. and Matsumoto N.
  • 雑誌名: J Hum Genet 巻: 69 ページ: 85-90
  • DOI: 10.1038/s10038-023-01209-2
  • 査読あり
• [雑誌論文] Novel missense variants cause intermediate phenotypes in the phenotypic spectrum of SLC5A6-related disorders (2024)
  • 著者名/発表者名: Utsuno Y., Hamada K., Hamanaka K., Miyoshi K., Tsuchimoto K., Sunada S., Itai T., Sakamoto M., Tsuchida N., Uchiyama Y., Koshimizu E., Fujita A., Miyatake S., Misawa K., Mizuguchi T., Kato Y., Saito K., Ogata K. and Matsumoto N.
  • 雑誌名: J Hum Genet 巻: 69 ページ: 69-77
  • DOI: 10.1038/s10038-023-01206-5
  • 査読あり
• [雑誌論文] Long-read sequencing revealing intragenic deletions in exome-negative spastic paraplegias (2023)
  • 著者名/発表者名: Fukuda H., Mizuguchi T., Doi H., Kameyama S., Kunii M., Joki H., Takahashi T., Komiya H., Sasaki M., Miyaji Y., Ohori S., Koshimizu E., Uchiyama Y., Tsuchida N., Fujita A., Hamanaka K., Misawa K., Miyatake S., Tanaka F. and Matsumoto N.
  • 雑誌名: J Hum Genet 巻: 68 ページ: 689-697
  • DOI: 10.1038/s10038-023-01170-0
  • 査読あり
• [雑誌論文] Three KINSSHIP syndrome patients with mosaic and germline AFF3 variants (2023)
  • 著者名/発表者名: Inoue Y., Tsuchida N., Okamoto N., Shuichi S., Ohashi K., Saitoh S., Ogawa A., Hamada K., Sakamoto M., Miyake N., Hamanaka K., Fujita A., Koshimizu E., Miyatake S., Mizuguchi T., Ogata K., Uchiyama Y. and Matsumoto N.
  • 雑誌名: Clin Genet 巻: 103 ページ: 590-595
  • DOI: 10.1111/cge.14292
  • 査読あり
• [雑誌論文] NOTCH2NLC GGC Repeat Expansion in Patients With Vascular Leukoencephalopathy (2023)
  • 著者名/発表者名: Liao Y. C., Wei C. Y., Chang F. P., Chou Y. T., Hsu S. L., Chung C. P., Mizuguchi T., Matsumoto N., Yet S. F. and Lee Y. C.
  • 雑誌名: Stroke 巻: 54 ページ: 1236-1245
  • DOI: 10.1161/STROKEAHA.122.041848
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Complete SAMD12 repeat expansion sequencing in a four-generation BAFME1 family with anticipation (2023)
  • 著者名/発表者名: Mizuguchi T., Toyota T., Koshimizu E., Kameyama S., Fukuda H., Tsuchida N., Uchiyama Y., Hamanaka K., Fujita A., Misawa K., Miyatake S., Adachi H. and Matsumoto N.
  • 雑誌名: J Hum Genet 巻: 68 ページ: 875-878
  • DOI: 10.1038/s10038-023-01187-5
  • 査読あり
• [雑誌論文] A case of epilepsy with myoclonic atonic seizures caused by SLC6A1 gene mutation due to balanced chromosomal translocation (2023)
  • 著者名/発表者名: Mori T., Sakamoto M., Tayama T., Goji A., Toda Y., Fujita A., Mizuguchi T., Urushihara M. and Matsumoto N.
  • 雑誌名: Brain Dev 巻: 45 ページ: 395-400
  • DOI: 10.1016/j.braindev.2023.03.001
  • 査読あり
• [雑誌論文] Biallelic structural variations within FGF12 detected by long-read sequencing in epilepsy (2023)
  • 著者名/発表者名: Ohori S., Miyauchi A., Osaka H., Lourenco C. M., Arakaki N., Sengoku T., Ogata K., Honjo R. S., Kim C. A., Mitsuhashi S., Frith M. C., Seyama R., Tsuchida N., Uchiyama Y., Koshimizu E., Hamanaka K., Misawa K., Miyatake S., Mizuguchi T., Saito K., Fujita A. and Matsumoto N.
  • 雑誌名: Life Sci Alliance 巻: 6 ページ: e202302025
  • DOI: 10.26508/lsa.202302025
  • 査読あり
• [雑誌論文] A novel homozygous CHMP1A variant arising from segmental uniparental disomy causes pontocerebellar hypoplasia type 8 (2023)
  • 著者名/発表者名: Sakamoto M., Shiiki T., Matsui S., Okamoto N., Koshimizu E., Tsuchida N., Uchiyama Y., Hamanaka K., Fujita A., Miyatake S., Misawa K., Mizuguchi T. and Matsumoto N.
  • 雑誌名: J Hum Genet 巻: 68 ページ: 247-253
  • DOI: 10.1038/s10038-022-01098-x
  • 査読あり
• [雑誌論文] A missense variant at the RAC1-PAK1 binding site of RAC1 inactivates downstream signaling in VACTERL association (2023)
  • 著者名/発表者名: Seyama R., Nishikawa M., Uchiyama Y., Hamada K., Yamamoto Y., Takeda M., Ochi T., Kishi M., Suzuki T., Hamanaka K., Fujita A., Tsuchida N., Koshimizu E., Misawa K., Miyatake S., Mizuguchi T., Makino S., Yao T., Ito H., Itakura A., Ogata K., Nagata K. I. and Matsumoto N.
  • 雑誌名: Sci Rep 巻: 13 ページ: 9789
  • DOI: 10.1038/s41598-023-36381-0
  • 査読あり
• [雑誌論文] Distal arthrogryposis in a girl arising from a novel TNNI2 variant inherited from paternal somatic mosaicism (2023)
  • 著者名/発表者名: Seyama R., Uchiyama Y., Kaneshi Y., Hamanaka K., Fujita A., Tsuchida N., Koshimizu E., Misawa K., Miyatake S., Mizuguchi T., Makino S., Itakura A., Okamoto N. and Matsumoto N.
  • 雑誌名: J Hum Genet 巻: 68 ページ: 363-367
  • DOI: 10.1038/s10038-022-01117-x
  • 査読あり
• [雑誌論文] Synchronous heart rate reduction with suppression-burst pattern in KCNT1-related developmental and epileptic encephalopathies (2023)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto K., Baba S., Saito T., Nakagawa E., Sugai K., Iwasaki M., Fujita A., Fukuda H., Mizuguchi T., Kato M., Matsumoto N. and Sasaki M.
  • 雑誌名: Epilepsia Open 巻: 8 ページ: 651-658
  • DOI: 10.1002/epi4.12705
  • 査読あり
• [学会発表] Complete SAMD12 repeat expansion sequencing in a four-generation BAFME1 family with anticipation (2023)
  • 著者名/発表者名: 水口剛
  • 学会等名: 第68回日本人類遺伝学会