| 研究課題/領域番号 |
23K18328
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
宮田 治彦 大阪大学, 微生物病研究所, 准教授 (50604732)
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| 研究期間 (年度) |
2023-06-30 – 2026-03-31
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| キーワード | 鞭毛 / 繊維鞘 / 精子運動性 |
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| 研究実績の概要 |
2023年度は、Afs1 (abnormal fibrous sheath 1) ノックアウト (KO) マウスの解析を行った。このKOマウスの精子では、繊維鞘形成の起点となる縦支柱が異所に形成される。まずは精子運動解析システム (CASA) を用いて精子の運動性を詳細に解析したところ、Afs1 KOマウスでは精子の運動率や運動速度の各種パラメーターが有意に低下していた。また、体外受精を行ったところ、Afs1 KO精子は卵子と受精しなかった。卵子の周りにある卵丘細胞の層を取り除いても、Afs1 KO精子は卵子と受精しなかった。一方、同じく卵子の周りにある透明帯を取り除くと、Afs1 KO精子でも卵子と受精することができた。よって、Afs1 KO精子は卵子透明帯を通過することができないと考えられる。
続いて、FLAGタグとビオチンリガーゼであるTurboIDが付加されたAFS1を発現するトランスジェニック (TG) マウスを作製した。このトランスジーンは、Afs1 KOマウスの生殖能力や精子運動性をレスキューすることができた。FLAG抗体を用いて、TGマウスの精巣切片の免疫染色を行ったところ、縦支柱が形成される時期の鞭毛にAFS1-FLAG-TurboIDが局在していることが分かった。一方で、精子形成後期にはAFS1-FLAG-TurboIDが鞭毛から消失していた。さらに、免疫電子顕微鏡法を用いてAFS1-FLAG-TurboIDの局在を解析したところ、精巣切片の免疫染色と同様の結果が得られた。AFS1-FLAG-TurboIDは縦支柱が形成される位置の微小管を含む、周辺微小管付近に局在していた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Afs1 KO精子は運動性低下のために透明帯を通過できないことが分かった。この精子運動性の低下は、Afs1のトランスジーンでレスキューすることができた。さらに、このTGマウスを用いてAFS1の局在を調べたところ、縦支柱の形成時期と一致することも分かった。
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| 今後の研究の推進方策 |
AFS1-FLAG-TurboID のTGマウスを用いて解析を行う。まずは、FLAG抗体を用いてAFS1-FLAG-Turbo1の免疫沈降を行い、質量分析によってAFS1と相互作用するタンパク質を探索する。また、このTGマウスではAFS1にビオチンリガーゼであるTurboIDが付加されている。そこで、TＧマウスにビオチンを投与することによってAFS1に近接するタンパク質をビオチン化し、質量分析を用いてビオチン化されたタンパク質を同定する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
Afs1 KOマウスの表現型解析とAFS1の局在解析に注力したため、AFS1と相互作用するタンパク質の探索は次年度に行うこととした。
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