| 研究課題/領域番号 |
23K19288
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| 研究機関 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 |
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研究代表者 |
轡田 圭又 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 高度分析研究センター, 研究員 (90969510)
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| 研究期間 (年度) |
2023-08-31 – 2025-03-31
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| キーワード | アミノアシルtRNA合成酵素 / 遺伝暗号拡張 / タンパク質立体構造予測 / ドッキングシュミレーション / 質量分析 |
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| 研究実績の概要 |
アミノアシルtRNA合成酵素(ARS)の部分改変による基質認識の改変は、タンパク質への非天然アミノ酸の導入を実現し、既存のタンパク質の物理化学特性の拡張を可能にする。一方で、有効な改変ARSの創出には多大な実験的探索と評価を必要とし、多くの人的・物的資源が費やされてきた。
このボトルネックの解消のため、本研究では構造未決定のカイコのARSを対象に、タンパク質に非天然アミノ酸を高効率に導入可能なARSのin silicoでの設計を試みる。具体的には、アミノ酸配列に基づくARSの予測立体構造を利用することで有効な改変部位および、改変するアミノ酸を推定可能か検証する。
本年度は非天然アミノ酸の導入評価に関して、当初想定していた分析機器との変更が生じたため、別の分析機器での分析系の立ち上げおよび、有効な改変部位の推定に取り組んだ。Alphafold2によって出力したチロシル tRNA 合成酵素(TyrRS)の予測構造とドッキングシュミレーションの結果から、改変残基候補を絞り込み複数の改変型TyrRSを設計した。カイコ培養細胞に改変型TyrRSを導入し、ターゲットタンパク質への非天然アミノ酸(3-azidotyrosine(3-AzTyr))の導入をMALDI-TOFMSで評価することで、設計の妥当性を検証した。現在までに測定機器の不調が発生したこともあり、予定していた分析を完遂できておらず、3-AzTyrの導入を確認できていない。今後は未完であった改変型TyrRSの評価を行い、本戦略の妥当性を検証する予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
上述の通り、本年度は分析系の立ち上げおよびin silicoでの推定と細胞系での検証によるTyrRSの有効な改変部位の推定に取り組んだ。in silicoでの解析では、環境構築において共通機器の計算資源では一部困難な点が判明したため、新たに計算環境を整備することで改変型TyrRSを設計に取り組んだ。一方で、新たに立ち上げた分析系の測定機器で不調が発生し、予定していた改変型TyrRSの評価が完了していない。現在は修理の完了により、分析が可能な状況となっている。
当初予定していた分析が未完であり、タンパク質への非天然アミノ酸の導入が確認できていないため、やや遅れていると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在はペプチドレベルでの導入評価を行っているが、非天然アミノ酸の導入は起こっているものの、非天然アミノ酸導入ペプチドの検出感度が低い可能性も考えられる。分析系として感度を上昇させ、定量性を担保するため、LC-MSを用いたタンパク質レベルでの評価を検討する。これにより、測定機器の不具合発生時にも対応できると考えられる。
in silicoにおけるTyrRSの設計に関しては当初の予定通り遂行するが、本分野は進展が著しく新たな手法やツールが常に発表され続けている。よって、新たな技術に関しても本研究に適用可能か検証を行う予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
新たな計算環境の整備により、設備備品費の購入計画に変更が生じたことに加え、当初予定していた分析を次年度に行うことになったため、次年度使用が生じた。
次年度の使用予定としては、当初の計画で購入を予定していた器具乾燥棚とサーマルサイクラーに関しては別途整備できたため、消耗品に大部分を当てることで、当初より多くの改変型TyrRSの評価を行っていく予定である。
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