エピオミクス１分子量子計測法の創成

2022 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 21H01741
• 配分区分: 補助金
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 大城 敬人 大阪大学, 産業科学研究所, 特任准教授(常勤) (10462665)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2026-03-31
• キーワード: 核酸塩基 / １分子計測 / 生体高分子 / エピオミクス / トンネル現象 / ナノデバイス

研究実績の概要

生体分子の疾病や環境変化にともなう分子修飾・分子ダメージを包括的に見るエピオミクスのためのナノ流路集積したデバイスによる１分子量子計測法の確立を行っている．今期，ナノ１分子量子計測法の計測効率を向上させるため，複数センサーギャップ電極を持つデバイスを作成した．これを用いて，血漿成分中に存在するDNAおよびRNAの核酸塩基鎖を捕集・精製し，脱塩処理をする試料調整法の確立を行った．こうした調整法を用いて，実試料中のメチル化（5mCやm6A），オキソメチル化（AOMe, GOMe等）の稀少エピ分子を含むRNAの計測を行った．その結果，miRNAの中のエピ修飾の割合を，修飾種と配列ごとに定量することに成功した．これまで，特定miRNA配列中の5mC修飾が近傍のm6A修飾を促進することを見出し，エピオミクスの存在を１分子レベルで確認することに可能であることを示した．またメチル化修飾以外の化学修飾種として，アセチル化やオキソ化，オキソメチル化，アルデヒド化核酸について1分子検出に成功した．驚くべきことは，がん患者中から抽出したマイクロRNAで，オキソメチル化したアデニンが存在することを１分子レベルではじめて検出し，他のRNAの化学修飾が，細胞の計時変化，サンプリング時期の変化により．修飾率が変化することから，修飾分子ごとの相関が１分子検出で得られた発見が裏付けられた．このことは，この１分子検出を基盤とした方法論が，１分子レベル明らかすることが，エピオミクスの包括的に理解することを可能であることを示す成果である．

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

本年度は，予定していた計測デバイスの要素技術としておこなっていたマルチ電極化について，予定通りの成果を挙げた．具体的には，計測デバイスのセンサー電極の多電極デバイスを作成し，その検討を行った．その結果，歩留まり90%以上の計測可能デバイスの作成に成功した．これまで，１センサー当たり平均5Mbase/dayであったことから，本年度のマルチ電極化の成果を用いることで，1000の並列化がデバイスの基板上で行うことができることを示した．このことは，競合の技術と同程度のデータ歳出能力をもつことを意味する大きなマイルストーンの達成である．このマルチ電極化の成果は，これまで化学種の多さにより困難であった他の生体分子への１分子計測法の応用の可能性をたかめる成果である．この成果をもとに，ペプチドシーケンサーに向けたアミノ酸種のコールデータベースのためのシグナルデータを光学異性体も含めて測定することに成功した．こうした生体分子の１分子計測を行うことができることから，生体試料のほぼすべての分子を対象にすることができることから，包括的な生体分子計測結果とこれを解析することで，生体中で起こる生理現象について様々理解することにつながった．

今後の研究の推進方策

今後は，開発した計測システムの応用に焦点を当て，生体分子の網羅的1分子計測研究分野の拡大を主眼に据える．一つ目は，稀少エピ分子を含めた核酸種を１３０程度に増やすことを目標とする．酵素種が既報の修飾塩基２０種ターゲットと，酵素種が不明であるが存在する修飾塩基および質量分析のみで示唆されている分子を１分子検出できることを目指す．二つ目として，臨床検体を用いた疾患診断および疾患の作用機序解明に関する研究を行う．具体的には，婦人科がん（子宮がん・卵巣癌）群，膀胱がん群，精神疾患群の尿サンプルや血漿サンプルによる疾患の有無識別，マーカーの発見や疾患メカニズムについて探る．三つ目として，核酸以外の生体分子種の識別検討を行う．その一つとして，ペプチドシーケンサーに向けたアミノ酸種や修飾アミノ酸種についてのコールデータベース，のデータベースおよびアルゴリズムの作成を行うことを目標とする．その他として，脂質や糖分子の識別に関する１分子検出をおこなう．これらの対象は，細胞修飾や核酸修飾などにより，免疫等の生理現象で重要な役割をはたしている一方，質量分析以外に有効な検出法がないために滞っている分野であることから，１分子計測技術によりこれらの分野への貢献が期待できると考えている．

研究成果

• [雑誌論文] Bio-molecular Sensing for Medical Applications Based on Single Molecule Electrical Measurement by Nanodevices Towards Medical Applications (2023)
  • 著者名/発表者名: Takahito Ohshiro
  • 雑誌名: Bunseki Kagaku 巻: 72 ページ: 87-95
  • DOI: 10.2116/bunsekikagaku.72.87
  • 査読あり
• [雑誌論文] Quantitative Microscopic Observation of Base-Ligand Interactions via Hydrogen Bonds by Single-Molecule Counting (2023)
  • 著者名/発表者名: Takashima Y, Komoto Y, Ohshiro T, Nakatani K, Taniguchi M,
  • 雑誌名: J.Am.Chem.Soc. 巻: 145 ページ: 1310-1318
  • DOI: 10.1021/jacs.2c11260
  • 査読あり
• [雑誌論文] １分子エピオミクス解析がひらく環境があたえる動植物への影響の理解と応用 (2023)
  • 著者名/発表者名: 大城敬人
  • 雑誌名: アグリバイオ 巻: 88 ページ: 394-399
• [雑誌論文] １分子量子計測が開く生命機能解明：1分子エピオミクスの解明 (2023)
  • 著者名/発表者名: 大城敬人
  • 雑誌名: 月刊 細胞 巻: 55 ページ: 58-62
• [雑誌論文] Establishment of a reference single-cell RNA sequencing dataset for human pancreatic adenocarcinoma (2022)
  • 著者名/発表者名: Chijimatsu R, Kobayashi S, Takeda Y, Kitakaze M, Tatekawa S, Arao Y, Nakayama M, Tachibana N, Saito T, Ennishi D, Tomida S, Sasaki K, Yamada D, Tomimaru Y, Takahashi H, Okuzaki D, Motooka D, Ohshiro T, Taniguchi M, Suzuki Y, Mimori K, Ogawa K, Mori M, Doki Y, Eguchi H, Ishii H
  • 雑誌名: iScience 巻: 25 ページ: 104659
  • DOI: 10.1016/10.101/j.isci.2022.104659
  • 査読あり
• [雑誌論文] Single-Molecule Classification of Aspartic Acid and Leucine by Molecular Recognition through Hydrogen Bonding and Time-Series Analysis (2022)
  • 著者名/発表者名: Ryu J., Komoto Y., Ohshiro T, Taniguch M
  • 雑誌名: Chem. Asian J 巻: 17 ページ: ,e202200179
  • DOI: 10.1002/asia.202200179
  • 査読あり
• [雑誌論文] Direct observation of DNA alterations induced by a DNA disruptor (2022)
  • 著者名/発表者名: Ohshiro T, Asai A, Konno M, Ohkawa M, Komoto Y, Ofusa, Ishii H, Taniguchi M
  • 雑誌名: Sci.Rep 巻: 12 ページ: 6945
  • DOI: 10.1038/s41598-022-10725-8
  • 査読あり
• [学会発表] ペプチド解析にむけた１分子検出法によるアミノ酸識別法の開発 (2023)
  • 著者名/発表者名: 大城敬人
  • 学会等名: 日本化学会第103春季年会
• [学会発表] ペプチドシーケンシングにむけた１分子検出法によるアミノ酸識別法の開発 (2023)
  • 著者名/発表者名: 大城敬人
  • 学会等名: 第70回応用物理学会春季学術講演
• [学会発表] リピドミクス解明に向けた1分子トンネル計測法の開発 (2022)
  • 著者名/発表者名: 大城敬人
  • 学会等名: 日本分析化学第71年会
• [学会発表] 分析化学におけるAIのセンサー応用の新展開 (2022)
  • 著者名/発表者名: 大城敬人
  • 学会等名: 日本分析化学第71年会
  • 招待講演
• [学会発表] １量子計測をもちいた１分子DNAメモリの開発 (2022)
  • 著者名/発表者名: 大城敬人
  • 学会等名: 第83回応用物理秋季学術講演会