| 研究課題/領域番号 |
21H02113
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究機関 | 弘前大学 |
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研究代表者 |
栗田 大輔 弘前大学, 農学生命科学部, 准教授 (60552651)
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| 研究分担者 |
葛西 秋宅 弘前大学, 医学研究科, 助教 (20609664)
行木 信一 群馬大学, 大学院理工学府, 准教授 (80302959)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | リボソーム |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、YaeJによるリボソームレスキュー機構の分子メカニズムを明らかにするために、YaeJ/リボソーム複合体に対して、機能解析および構造解析を行うものである。令和5年度は部位特異的ラジカルプロービングおよびクライオ電子顕微鏡による立体構造解析を中心に進めた。昨年度まではYaeJのC末端に集中的にシステインを導入した変異体を作製してきたが、今年度はN末端（ペプチジルtRNA加水分解の活性中心付近）の変異体を多数作製した。YaeJのC末端に変異を導入するとリボソームへの結合活性が低下するものが多く見られたが、N末端の変異体では、そのような変異体はほとんど見られなかった。この変異体を用いてラジカルプロービングを行った。C末端の変異体と異なり、rRNAの切断を示すものは少なかったが、一部で23S rRNAを切断するものが得られた。YaeJのC末端変異体はすべて16S rRNAを切断するものしか得られなかったが、今回得られた変異体は、リボソーム中でのYaeJのN末端ドメインの位置情報を与えるものであり、興味深いものである。
次に、クライオ電子顕微鏡による立体構造解析を行った。現在、複合体の解析を進めており画像解析を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ラジカルプロービング解析について、これまで使用していた蛍光DNAシークエンサーが経年劣化により使用不可能になった。代わりの装置を使用して続けているが、使用する蛍光試薬が異なるため、全てのデータを取り直す必要に迫られた。幸い、タンパク質およびリボソームのサンプルは十分な量を調製していたため、大きな遅れとはならずに済んでいる。クライオ電子顕微鏡解析に着手し、順調にデータを得ている。
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| 今後の研究の推進方策 |
ラジカルプロービング解析は、引き続きYaeJのシステイン変異体を増やして複合体の構造解析を進めていく。作製した変異体の中に興味深い活性を示すものを得たため、バイオレイヤー干渉法およびin vitro翻訳系によるペプチジルtRNA加水分解活性によって、変異が活性に与える影響を明らかにする予定である。また、クライオ電子顕微鏡による立体構造解析については、画像解析に時間を要するため引き続き進めていく。
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