| 研究課題/領域番号 |
21H02124
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究機関 | 茨城大学 |
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研究代表者 |
鈴木 義人 茨城大学, 農学部, 教授 (90222067)
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| 研究分担者 |
土田 努 富山大学, 学術研究部理学系, 准教授 (60513398)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | ゴール / 虫こぶ / オーキシン / サイトカイニン / インドール酢酸 / 生合成 / アブラムシ / 阻害剤 |
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| 研究実績の概要 |
ハバチにおけるIAA生合成の鍵となるトリプトファン(Trp)からインドールアセトアルデヒド(IAAld)への変換を触媒する芳香族アルデヒド合成酵素 (AAS) PonAAS2は，昆虫でこれまでに解析されたAASの中でTrpを基質とする唯一の酵素である。バラハタマバチのAASであるDjAAS2とPonAAS2間で基質認識アミノ酸は保存されているにもかかわらず，DjAAS2はTrpを基質とせず，主要な基質はDopaである。セグメントシャフリングやアミノ酸置換実験により，PonAAS2のDopa変換能を残したままTrp変換能を消失させることに成功し，基質特異性の違いに関与する構造を絞り込むことが出来た。また，1 uM程度のIC50を示す新たなPonAAS2の阻害剤を見出した。一方，線虫を用いてPonAAS2が個体レベルで高いIAA生産能を与える遺伝子として利用出来ることを示したが，非ゴール形成昆虫であるエンドウヒゲナガアブラムシ(Api)では未だ外来遺伝子の発現法の開発に成功していない。ApiのAASは大腸菌発現による活性が認められず，IAA生合成への関与が不明だが，ゲノム編集により胚発生途上の卵における遺伝子破壊が確認されており，破壊系統の確立を行っている。サイトカイニン(CK)の生合成候補遺伝子であるtRNA-IPTのゲノム編集も試みているが，現時点で遺伝子破壊は確認出来ていない。一方，側鎖が水酸化されたCKとゴール形成との関連性が示されているが，tZ型CKをもつApiにおいてシトクロムP450(CYP)系の阻害剤に暴露させることにより，tZ型CKが減少する一方で水酸化を受けないCKが増加する傾向が見られ，水酸化酵素としてCYPの関与の可能性が示された。また，共生微生物のブフネラを除去してもCK量に変化がなく，研究対象をApiゲノムにコードされたCYPに絞り込んだ。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
昆虫は広くIAAを内生しているにもかかわらず，ハバチが独自のIAA生合成機構を獲得した可能性が強まり，またその基質認識機構に関与する構造が明らかになりつつある点は当初の計画では想定していなかった成果である。一方，エンドウヒゲナガアブラムシ(Api)における遺伝子導入には技術的な壁に阻まれ，現状で打開策は明らかになっておらず，今後の課題である。しかし，未だ成功例の少ないApiにおけるゲノム編集による遺伝子破壊については，胚発生の段階での成功例が確認され，今後の遺伝子破壊系統の確立には相当の手間がかかるものの，一応の技術的な見通しが立ったと言える。また，PonAAS2の新たな阻害剤は以前得られたものより数百倍高活性であり，AASと同じファミリーである芳香族アミノ酸脱炭酸酵素に対する阻害活性は弱いことから，ハバチに対して適用できる可能性が十分に考えられる。さらにサイトカイニンの側鎖の水酸化酵素がCYPである可能性が高くなり，研究対象を絞り込むことが出来た点も重要な成果である。
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| 今後の研究の推進方策 |
PonAAS2は2量体として働くが，各モノマーの配向が活性の強弱に関与している可能性が高い。昨年度から共同研究を開始したバイオインフォマティクスを専門とする研究者と相談しながら，モノマーの配向への影響を考慮しつつ，基質特異性の差異をより明瞭に際立たせる変異酵素の作成を目指す。新たに得られたPonAAS2の阻害剤については，ハバチの個体レベルでIAA生合成を阻害するための投与法を検討する。エンドウヒゲナガアブラムシ(Api)における遺伝子導入については，二本鎖DNAの不安定性が問題である可能性が高く，PiggyBACによるゲノムへの組み込みが可能な鱗翅目昆虫の幼虫を比較対象として安定性の解析を行うと共に，その分解の様子に応じて，修飾による安定性の付与を検討する。ApiのtRNA-IPTおよびApAAS1についてはゲノム編集による遺伝子破壊系統の確立を目指す。サイトカインの水酸化酵素は，in vitroでの水酸化酵素活性の検出系を立ち上げ，in vitroでも阻害剤の効果があることを確認した上で，CYPの関与に確信が持てた場合は，酵母における発現系によって水酸化酵素の同定を行う。
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