| 研究課題/領域番号 |
21H02199
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究機関 | 摂南大学 |
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研究代表者 |
海道 真典 摂南大学, 農学部, 准教授 (20314247)
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| 研究分担者 |
竹田 篤史 立命館大学, 生命科学部, 教授 (60560779)
松村 浩由 立命館大学, 生命科学部, 教授 (30324809)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2026-03-31
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| キーワード | RNAウイルス / 複製複合体 / 移行タンパク質 / 小胞体膜 / 細胞内輸送システム |
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| 研究実績の概要 |
プラス鎖RNAウイルスであるRed clover necrotic mosaic virus（RCNMV）の複製複合体（Virus replication complex; VRC)の形成過程を、二本鎖RNA結合タンパク質（B2）と緑色蛍光タンパク質（GFP)との融合タンパク質を発現する形質転換B2-GFP植物タバコ植物を利用して、共焦点顕微鏡観察によって明らかにした。RCNMVを接種したB2-GFP植物では、二本鎖RNA顆粒は接種5時間後に極小の顆粒状構造として、小胞体膜の近傍で形成され始め、衝突と融合を繰り返しつつ、接種約24時間後には核と同程度の大きさの凝集体へと成長した。これらの顆粒状構造も凝集体も、一貫してウイルス複製酵素タンパク質p27が共局在したことから、VRCであることがわかった。しかしRCNMV MPは別個の顆粒として形成され始め、VRCの顆粒が少し大きくなった段階から共局在することがわかった。また感染後期のVRC凝集体はRCNMVの細胞間移行には必要ではないことがわかった。
さらにMPと細胞内で結合するタンパク質をコードする遺伝子について、それぞれ遺伝子サイレンシングを誘導してRCNMV増殖への影響を調べたところ、ストレス顆粒形成に関与するAngustifolia遺伝子がウイルス増殖を抑制する因子であることが判明した。
また、MPを大腸菌に発現させて精製する条件を検討しており、幾つかの条件設定が出来た。これに引き続き、RCNMVの細胞間移行に関与する宿主タンパク質GAPDH-Aの発現・精製条件の検討を続けている。
また、RCNMVと同科のカーネーション斑紋ウイルスの2種類の移行タンパク質のうち、一方はウイルス移行機能に必須であるが、もう一方は必須ではないことが判明した。現在同ウイルスのVRC形成について、B2-GFP植物を利用したアッセイを継続中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
昨年度はRCNMVの複製複合体（VRC）の形成過程を、二本鎖RNA結合マーカー発現形質転換植物を利用して詳細に解析し、複製酵素タンパク質との共局在性と小胞体膜との関連性が感染極初期には小さく、後期には大きくなること、移行タンパク質（MP）との局在が感染後しばらく経ってから起こることなど、ウイルスの感染戦略と関連した興味深い現象を見出し、投稿論文として発表した。
またカーネーション斑紋ウイルスの複製および移行の分子生物学的研究のために必要な、感染性cDNAの構築と、幾つかの蛍光タンパク質との融合タンパク質発現システムなどを構築することが出来た。
MPの立体構造決定のための大腸菌による発現システムと精製の試みに関しては予想より少々遅れが見られるものの、全体としては順調と言える。
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| 今後の研究の推進方策 |
RCNMVのVRCとMP顆粒の形成メカニズムに関して、液-液相分離が関与する可能性について検討する。具体的には、タンパク質の液-液相分離において重要な役割を担うDisordered regionが複製酵素タンパク質p27とMPに含まれるので、この部分への変異や、この部分のみを取り出して解析を行う。また、相分離の阻害薬剤の投与によるVRC顆粒形成への影響を詳細に解析する。また、同領域に含まれるセリン、トレオニンなどのリン酸化される可能性のあるアミノ酸に変異を導入し、VRC顆粒形成への影響を調べる予定である。
また、RCNMV MPと結合する、ウイルス増殖関連宿主因子遺伝子の候補について、引き続きウイルス誘導遺伝子サイレンシング等の手法を用いたアッセイによって、ウイルス増殖への関連の有無についての検定を行う。
また、国内で発生が確認されており且つRCNMVと近縁関係にはない数種類のRNAウイルスを新たに取り寄せ、これらの感染性cDNAクローンを作製し、分子生物学的調査を行うための基盤整備を行い、RNAウイルスの複製と細胞間移行機構について調査を行う。
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