| 研究課題/領域番号 |
21H02462
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究機関 | 東海大学 |
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研究代表者 |
谷口 俊恭 東海大学, 医学部, 教授 (60794534)
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| 研究分担者 |
渡邊 孝明 東海大学, 医学部, 講師 (20421365)
石井 恭正 東海大学, 医学部, 准教授 (20548680)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2026-03-31
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| キーワード | DNA修復 / 紫外線 / microRNA / がん |
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| 研究実績の概要 |
本研究はmicroRNA生合成とDNA修復という二つの分野を結ぶ新しい研究領域の創生を目指している。紫外線(UV)はDNAを損傷し癌化を誘発する。UVによるDNA損傷はヌクレオチド除去修復で修復される。我々は、miRNA生合成に関わるRNA結合蛋白DGCR8のSerine153 (S153)のリン酸化が転写と共役したヌクレオチド除去修復を制御すること、DGCR8のパートナーであるDroshaも細胞のUV抵抗性に関わることを発見し、新規DNA修復制御経路DGCR8-mediated UV response pathwayを提唱した。このpathwayの生体内での役割の解明、制御メカニズムの解明が残された重要な課題であった。そこで現在までにこのpathwayの機能に必須なS153のリン酸化が起きないようにS153をalanineに置換したDgcr8 S153A変異マウスをCRISPR-CAS9 systemを用いて作成した。また、紫外線起因皮膚がんの発症抑制にこのpathwayが関与すると仮説し、Dgcr8 S153A/S153A, S153A/wt, wt/wtのgenotypeのマウスに紫外線(UV-B)を照射し腫瘍の発生を観察する実験を開始した。さらにこれらのgenotypeのマウス胎児線維芽細胞を作成し、その解析も始めている。またDroshaの紫外線抵抗性への関与の機序を解明するために、CRISPR-CAS9システムを用いてknockout細胞を作成した。これらの成果は、Dgcr8, Droshaの紫外線応答における役割を解明するための重要なツールを作成できたことを意味し、本年度以降に行うDGCR8-mediated UV response pathwayの生体内での役割の解明、制御メカニズムの解明に向けての重要なステップと位置づけられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
「DGCR8-mediated UV response pathwayはin vivoでも転写と共役したヌクレオチド除去修復(TC-NER)を制御することによりUVによるDNA損傷の修復に関わり、UV起因発ガンの抑制に働く」という仮説を検証するため、このpathwayの機能に必須なS153のリン酸化が起きないようにS153をalanineに置換したDgcr8 S153A変異マウスを既に作成した。またDgcr8 S153A/S153A, S153A/wt, wt/wtのgenotypeを持つマウス胎児線維芽細胞(mouse embryonic fibroblasts (MEF))を樹立した。これらのMEFを用いてすでにDGCR8, CSB, RNApolymeraseの相互作用を検討した。
TC-NERが機能しないCsb欠損・Csa欠損マウスはUV-B照射により皮膚腫瘍を発症することから、S153A変異マウスでもUV-B照射後に皮膚腫瘍が生じることが予想される。そこでDgcr8 S153A変異マウス個体での腫瘍の発生を調べるために、S153A/S153A, S153A/wt, wt/wt それぞれ10匹ずつマウスを用い、背部皮膚を脱毛処理後UV-B週4日20週照射を行った。照射開始から50週まで皮膚腫瘍の出現を比較する計画であり、現在実験が進行中である。
また、CRISPR-CAS9システムを用いて、Drosha, Pol ηのknockout 細胞を作成することができた。
ここまでの実験はほぼ計画通り進行している。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度は、すでに実験進行中のDgcr8 S153A/S153A, S153A/wt, wt/wtマウスの自然発症の腫瘍及びUV-B照射後の皮膚腫瘍の頻度・組織型を解析する予定である。
また、樹立したDgcr8 S153A/S153A, S153A/wt, wt/wtのgenotypeを持つマウス胎児線維芽細胞(mouse embryonic fibroblasts (MEF))を用いて、UV感受性、UV照射後のDNA修復過程(CPD,6-4PP定量)、UV照射後RNA合成回復(TC-NERの指標) の解析を行う予定である。これらの実験によりS153リン酸化によるTC-NER制御の生体内での役割を検証する。
また、CRISPR-CAS9システムを用いて作成したDrosha, Pol ηのknockout 細胞を用いて、Droshaが紫外線抵抗性を制御するメカニズムの解析を行う予定である。
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