研究課題
CRISPR-gRNA libraryによる網羅的遺伝子ノックアウトを活用した新しい「癌－免疫チェックポイント標的」を同定することを目指して、T細胞および腫瘍細胞に焦点を当てて研究を行った。T細胞の機能低下に関与する遺伝子として前年度までに遺伝子X（未公表のため仮称）を同定し、遺伝子XをT細胞で特異的に欠損するコンディショナルノックアウトを作製した。遺伝子X欠損腫瘍抗原特異的T細胞は野生型に比較し腫瘍局所に集積することが明らかとなっていたが、そのメカニズムは不明であった。本年度では、この優先的な集積にはリンパ節から腫瘍へのT細胞の動員・マイグレーションなどの観点から評価したが、これらは遺伝子X欠損T細胞の腫瘍局所への集積に影響がなかった。さらに解析を進めた結果、低栄養（低サイトカイン）環境下でのアポトーシスへの抵抗性が認められ、このアポトーシス抵抗性が腫瘍局所での優先的な集積・蓄積に関与していることが示唆された。また、ヒトのT細胞でも遺伝子Xを欠損させると強い抗腫瘍効果が認められるか調べるため、遺伝子X欠損CD19-CAR-T細胞を作製した。また癌細胞の免疫原性を高める標的遺伝子の探索も実施した。癌細胞の免疫原性はneo-antigenの発現の有無（多寡）・MHC class Iおよびclass IIの発現量に決定されると考えられる。また抗原性の高いneo-antigenはMHC class Iの発現を安定化させ、その発現量を増大させることが知られていることから、MHC class I発現を増強させる新規標的遺伝子の同定を試みた。そのために、MHC class I発現が低いB16メラノーマ細胞にCas9タンパクを発現させ、CRISPR gRNA libraryを導入し、その後フローサイトメーターでMHC class I発現が高い細胞集団を濃縮している。
2: おおむね順調に進展している
マウスで得られた知見をヒトT細胞へ応用する段階まで進んでおり、予定以上に進行している。しかし免疫原性を高める標的遺伝子の探索には時間がかかっており、細胞株の再検討も視野に入れている。計画全体としては概ね順調に進展していると考えている。
マウスで認められた遺伝子X欠損T細胞の強い抗腫瘍効果がヒトT細胞でも同じように認められるか検討するためにCD19-CAR-T細胞療法を用いる。CD19-CAR-T細胞療法は基本的にB細胞腫瘍を標的としているため、マウスモデルで行った腫瘍実験とは異なる。そのため、CD19を発現するヒトメラノーマ細胞株を樹立しCD19-CAR-T細胞療法モデルを確立する。また、前年度までにCas9発現TCF-1レポーターマウスを用いて癌免疫療法の基盤であるTCF-1陽性T細胞の誘導・維持に関与する遺伝子のスクリーニングを実施している。次年度では、同定された候補遺伝子の更なる絞り込み・その機能評価を行う。具体的には、各候補遺伝子を欠損させたT細胞を作製し、in vitroでのTCF1発現維持を評価するとともに、そのTCF1発現の維持が免疫に及ぼす影響を調べるために、リステリア菌感染症モデルや腫瘍モデルを用いて検討する。
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Cancer Immunology, Immunotherapy
巻: 72 ページ: 2347～2356
10.1007/s00262-023-03420-8
