ダウン症候群に伴う急性巨核芽球性白血病発症の分子機構の解明と分子標的療法の開発

2021 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 21H02877
• 配分区分: 補助金
• 研究機関: 弘前大学
• 研究代表者: 伊藤 悦朗 弘前大学, 医学研究科, 特任教授 (20168339)
• 研究分担者: 土岐 力 弘前大学, 医学研究科, 講師 (50195731) ; 照井 君典 弘前大学, 医学研究科, 教授 (00333740) ; 工藤 耕 弘前大学, 医学部附属病院, 助教 (20455728) ; 金崎 里香 弘前大学, 医学研究科, 助教 (60722882) ; 佐藤 知彦 弘前大学, 医学部附属病院, 助教 (70587005)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2025-03-31
• キーワード: ダウン症候群 / 急性巨核芽球性白血病 / GATA1 / MYC / 分子標的療法

研究実績の概要

ダウン症新生児の約10%にTAMと呼ばれる前白血病が発症し、その約20%は急性巨核芽球性白血病 (DS-AMKL)に進展する。我々は、DS-AMKLの新規原因遺伝子を10種類以上見出した。本研究では、新規遺伝子変異の機能解析とその結果に基づく治療法の開発を異なる３つのシステム（DS-AMKL細胞株、遺伝子改変マウス、ゼノグラフトモデル）を用いて行い、白血病の多段階発症の分子機構を解明し、治療法の開発のために様々な遺伝子変異によって共通に障害される経路を明らかにする。令和３年度は以下の解析を行った。
1. X遺伝子の機能解析：DS-AMKLで高頻度に検出されたX変異の機能解析のために、ノックイン（KI) マウスを作製した。フローサイトメトリー法を用いて造血幹細胞・前駆細胞数を解析し、造血幹細胞を純化してATAC-seq及びRNA-seqを行った。その結果、X-PTDは部分的な機能喪失変異であり、X-PTD KIマウスではリンパ球系及び骨髄球系造血が障害されていることが明らかになった。X-PTD KIマウスとGATA1sのみを発現するGATA1sマウスとの交配実験を行い経過観察したところ、骨髄異形症候群や白血病が発症した。
2. N遺伝子の機能解析：野生型Nを発現誘導可能なDS-AMKL細胞株を樹立した。RNAシークエンスで野生型NFIAにより誘導される遺伝子を網羅的に解析し、GSEAなどでパスウェイ解析を行った。その結果、遺伝子変異によりMYC/E2F経路の抑制が障害されることが明らかになった。
3. MYCを標的とした新規治療法の開発：DS-AMKL患者検体を用いて、BRD4インヒビターの感受性試験をin vitroで行う予定であった。しかし、芽球頻度が高く、細胞数が十分である解析可能な検体が今年度は入手できなかったため、実施できなかった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本年度の目的は、画期的な新規治療法を開発するためにDS-AMKL特異的遺伝子変異の機能解析を行い、白血病の多段階発症の分子機構を解明することである。本年度は、以下の研究成果が得られ、概ね順調に研究が進展している。
1. 我々が作製したX-PTDノックイン（KI) マウスは、白血球減少と血小板減少を認め、高率に白血病（T-ALL）を発症した。白血病発症の仕組みを解明するために、フローサイトメトリー法を用いて造血幹細胞・前駆細胞数を解析した。その結果、造血幹細胞、リンパ球共通前駆細胞などが減少しており、骨髄球系およびリンパ球系造血の両者が障害されていることが明らかになった。次に、造血幹細胞を純化してATAC-seq及びRNA-seqを行った。その結果、X-PTD KIマウスの幹細胞は、遺伝子発現パターンとオープンクロマチン領域がX遺伝子のノックアウトマウスと類似しており、X-PTDは機能喪失変異であることが示唆された。X-PTD KIマウスとGATA1sのみを発現するGATA1sマウスとの交配したところ、骨髄異形症候群（MDS）や白血病が発症し、DS-AMKLのモデルマウス作成が前進した。
2. N遺伝子の機能解析の結果、既に解析を終えているI遺伝子及びZ遺伝子と同様に、N遺伝子もMYC自身を含めたMYC/E2F経路を抑制することにより、がん抑制遺伝子として機能していることが明らかになった。MYCのスーパーエンハンサーを抑制してMYCの発現を抑制するBRD4阻害剤は、これらの遺伝子が変異している４つのDS-AMKL細胞株にいずれも感受性が高い。本年度の解析結果により、BRD4阻害剤がDS-AMKLの新たな分子標的薬剤の有力な候補となることが裏付けられた。
3. MYCを標的とした新規治療法の開発：DS-AMKL患者検体を用いて、BRD4インヒビターの感受性試験をin vitroで行う予定であったが、検体入手が難しく、実施できなかった。

今後の研究の推進方策

今後は、昨年度の研究成果をもとに、申請者らが発見したDS-AMKLの新規遺伝子変異の機能解析を継続し、白血病の多段階発症の分子機構を解明し、様々な遺伝子変異によって共通に障害される経路を明らかにする。
1. X-PTD KIマウスとGATA1sマウスとの交配実験を行い、AMKL発症の有無を観察する。初年度の解析でMDSあるいは白血病の発症が認められた。フローサイトメトリー法で腫瘍細胞の表面マーカーを解析し、白血病のサブタイプを解析する。さらに、発症前の骨髄あるいは脾臓細胞を用いてフローサイトメトリー法で造血幹細胞・前駆細胞数を解析し、造血幹細胞を純化してATAC-seq及びRNA-seqを行う。さらに、腫瘍細胞のエクソーム解析を行い、付加的遺伝子異常を解析する。

2. 初年度の解析で、N遺伝子もMYCパスウェイを抑制することが確認されたため、N遺伝子によるMYCパスウェイ の抑制メカニズムについても解析を行う。なお、 I遺伝子については、その結合配列も明らかではなく、予備実験でもChIP-seqに使用できる抗I抗体はコマーシャルベースではなかった。このため、FLAGタッグを結合したI発現ベクターを構築し、DS-AMKL細胞株に発現させ、抗F抗体でChIP-seqを行う。平行して、抗IRX1ポリクロナール抗体を作製し、ChIP-seq用の抗体を確保する。
3. 我々は、MYCシグナリング経路がI、ZおよびN変異で共通に障害されることを見出した。MYC経路の下流にはサイクリンD・CDK4/6・RB1経路が存在することから、BRD4インヒビターの感受性試験に加え、実際に臨床で使用可能なCDK4/6インヒビター (Palbociclib) のDS-AMKL細胞株に対する感受性試験を行う。

研究成果

• [雑誌論文] Ribosomal protein L5 facilitates rDNA-bundled condensate and nucleolar assembly (2022)
  • 著者名/発表者名: Matsumori Haruka、Watanabe Kenji、Tachiwana Hiroaki、Fujita Tomoko、Ito Yuma、Tokunaga Makio、Sakata-Sogawa Kumiko、Osakada Hiroko、Haraguchi Tokuko、Awazu Akinori、Ochiai Hiroshi、Sakata Yuka、Ochiai Koji、Toki Tsutomu、Ito Etsuro、Goldberg Ilya G、Tokunaga Kazuaki、Nakao Mitsuyoshi、Saitoh Noriko
  • 雑誌名: Life Science Alliance 巻: 5 ページ: -
  • DOI: 10.26508/lsa.202101045
  • 査読あり
• [雑誌論文] Isolated Bone Recurrence of Medulloblastoma With MYCN Amplification and TP53 Loss: A Case Report (2022)
  • 著者名/発表者名: Takahashi Yuka、Kudo Ko、Ogawa Kaoru、Sato Tomohiko、Kamio Takuya、Sasaki Shinya、Kobayashi Akie、Ito Tatsuya、Yamamoto Tatsuya、Asano Kenichiro、Ohkuma Hiroki、Kurose Akira、Ito Etsuro、Terui Kiminori
  • 雑誌名: Journal of Pediatric Hematology/Oncology 巻: 44 ページ: e593～e596
  • DOI: 10.1097/MPH.0000000000002234
  • 査読あり
• [雑誌論文] Dyserythropoietic anaemia with an intronic GATA1 splicing mutation in patients suspected to have Diamond-Blackfananaemia. (2022)
  • 著者名/発表者名: Kobayashi A, Ohtaka R, Toki T, Hara J, Muramatsu H,Kanezaki R, Takahashi Y, Sato T, Kamio T, Kudo K, Sasaki S, Yoshida T, Utsugisawa T, Kanno H, Yoshida K, Nannya Y, Takahashi Y, Kojima S, Miyano S, Ogawa S, Terui K, Ito E
  • 雑誌名: eJHaem 巻: 3 ページ: 163-167
  • DOI: 10.1002/jha2.374
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Childhood acute myeloid leukemia with 5q deletion and <i>HNRNPH1-MLLT10</i> fusion: The first case report (2022)
  • 著者名/発表者名: Kudo Ko、Kubota Yasuo、Toki Tsutomu、Kanezaki Rika、Kobayashi Akie、Sato Tomohiko、Kamio Takuya、Sasaki Shinya、Shiba Norio、Tomizawa Daisuke、Adachi Souichi、Yoshida Kenichi、Ogawa Seishi、Seki Masafumi、Takita Junko、Terui Kiminori
  • 雑誌名: Blood Advances 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1182/bloodadvances.2021006383
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] BRAFV600E-positive cells as molecular markers of bone marrow disease in pediatric Langerhans cell histiocytosis (2022)
  • 著者名/発表者名: Kudo K, Toki T, Kanezaki R, Tanaka T, Kamio T, Sato T, Sasaki S, Terui K, Ito E, et al.
  • 雑誌名: Haematologica 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.3324/haematol.2021.279857
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Clinical and genetic diagnosis of thirteen Japanese patients with hereditary spherocytosis (2022)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto KS, Utshigisawa T, Ogura H, Aoki T, Kawakami T, Ohga S, Ohara A, Ito E, Yamamoto T, Kanno H
  • 雑誌名: Hum Genome Var 巻: 9 ページ: -
  • DOI: 10.1038/s41439-021-00179-1
  • 査読あり
• [雑誌論文] A Case of Congenital Leukemia With MYB-GATA1 Fusion Gene in a Female Patient (2022)
  • 著者名/発表者名: Ozono S, Yano S, Oishi S, Mitsuo M, Nakagawa S, Toki T, Terui K, Ito E
  • 雑誌名: J Pediatr Hematol Oncol 巻: 44 ページ: e250-e252
  • DOI: 10.1097/MPH.0000000000002119
  • 査読あり
• [雑誌論文] Enzymatic Changes in Red Blood Cells of Diamond-Blackfan Anemia (2021)
  • 著者名/発表者名: Utsugisawa T, Uchiyama T, Toki T, Shimojima-Yamamoto K, Ohga S, Ito E, Kanno H
  • 雑誌名: Tohoku J Exp Med 巻: 255 ページ: 49-55
  • DOI: 10.1620/tjem.255.49
  • 査読あり
• [雑誌論文] New insights into inherited bone marrow failure syndrome (2021)
  • 著者名/発表者名: Ito E, Toki T, Kamio T, Terui K
  • 雑誌名: Rinsho Ketsueki 巻: 62 ページ: 1455-1464.
  • DOI: 10.11406/rinketsu.62.1455
  • 査読あり
• [雑誌論文] Post-induction MRD by FCM and GATA1-PCR are significant prognostic factors for myeloid leukemia of Down syndrome (2021)
  • 著者名/発表者名: Taga T, Tanaka S, Hasegawa D, Terui K, Toki T, Iwamoto S, Hiramatsu H, Miyamura T, Hashii Y, Moritake H, Nakayama H, Takahashi H, Shimada A, Taki T, Ito E, Hama A, Ito M, Koh K, Hasegawa D, Saito AM, Adachi S, Tomizawa D
  • 雑誌名: Leukemia 巻: 35 ページ: 2508-2516
  • DOI: 10.1038/s41375-021-01157-w
  • 査読あり
• [雑誌論文] Predictive factors for the development of leukemia in patients with transient abnormal myelopoiesis and Down syndrome (2021)
  • 著者名/発表者名: Yamato G, Deguchi T, Terui K, Toki T, Watanabe T, Imaizumi T, Hama A, Iwamoto S, Hasegawa D, Ueda T, Yokosuka T, Tanaka S, Yanagisawa R, Koh K, Saito AM, Horibe K, Hayashi Y, Adachi S, Mizutani S, Taga T, Ito E, Watanabe K, Muramatsu H
  • 雑誌名: Leukemia 巻: 35 ページ: 1480-1484
  • DOI: 10.1038/s41375-021-01171-y
  • 査読あり
• [雑誌論文] Association of Multiple Gene Polymorphisms Including Homozygous NUDT15 R139C With Thiopurine Intolerance During the Treatment of Acute Lymphoblastic Leukemia (2021)
  • 著者名/発表者名: Kudo K, Sato T, Takahashi Y, Yuzawa K, Kobayashi A, Kamio T, Sasaki S, Shimada J, Otani K, Tusjimoto S, Kato M, Toki T, Terui K, Ito E
  • 雑誌名: J Pediatr Hematol Oncol 巻: 43 ページ: e1173-e1176
  • DOI: 10.1097/MPH.0000000000002085
  • 査読あり
• [雑誌論文] Usefulness of functional splicing analysis to confirm precise disease pathogenesis in Diamond-Blackfan anemia caused by intronic variants in RPS19 (2021)
  • 著者名/発表者名: Takafuji S, Mori T, Nishimura N, Yamamoto N, Uemura S, Nozu K, Terui K, Toki T, Ito E, Muramatsu H, Takahashi Y, Matsuo M, Yamamura T, Iijima K
  • 雑誌名: Pediatr Hematol Oncol 巻: 38 ページ: 515-527
  • DOI: 10.1080/08880018.2021.1887984
  • 査読あり
• [雑誌論文] Fluctuations in internal cerebral vein and central side veins of preterm infants (2021)
  • 著者名/発表者名: Ikeda T, Ito Y, Mikami R, Matsuo K, Kawamura N, Yamoto A, Ito E
  • 雑誌名: Pediatr Int 巻: 63 ページ: 1319-1326
  • DOI: 10.1111/ped.14638
  • 査読あり
• [雑誌論文] Analysis of disease model iPSCs derived from patients with a novel Fanconi anemia-like IBMFS ADH5/ALDH2 deficiency (2021)
  • 著者名/発表者名: Mu A, Hira A, Niwa A, Osawa M, Yoshida K, Mori M, Okamoto Y, Inoue K, Kondo K, Kanemaki MT, Matsuda T, Ito E, Kojima S, Nakahata T, Ogawa S, Tanaka K, Matsuo K, Saito MK, Takata M
  • 雑誌名: Blood 巻: 137 ページ: 2021-2032
  • DOI: 10.1182/blood.2020009111
  • 査読あり
• [雑誌論文] Reduced-intensity conditioning is effective for hematopoietic stem cell transplantation in young pediatric patients with Diamond-Blackfan anemia (2021)
  • 著者名/発表者名: Koyamaishi S, Kamio T, Kobayashi A, Sato T, Kudo K, Sasaki S, Kanezaki R, Hasegawa D, Muramatsu H, Takahashi Y, Terui K, Ito E, et al.
  • 雑誌名: Bone Marrow Transplant 巻: 56 ページ: 1013-1020
  • DOI: 10.1038/s41409-020-01056-1.
  • 査読あり
• [雑誌論文] An international retrospective study for tolerability of 6-mercaptopurine on NUDT15 bi-allelic variants in children with acute lymphoblastic leukemia (2021)
  • 著者名/発表者名: Tanaka Y, Yeoh AEJ, Moriyama T, Li CK, Kudo K, Arakawa Y, Buaboonnam J, Zhang H, Liu HC, Ariffin H, Chen Z, Kham SKY, Nishii R, Hasegawa D, Fujimura J, Keino D, Kondoh K, Sato A, Ueda T, Yamamoto M, Taneyama Y, Hino M, Takagi M, Ohara A, Ito E, Koh K, Hori H, Manabe A, Yang JJ, Kato M
  • 雑誌名: Haematologica 巻: 106 ページ: 2026-2029
  • DOI: 10.3324/haematol.2020.266320
  • 査読あり
• [学会発表] GATA1変異によるDown症候群関連急性巨核芽球性白血病発症の仕組み (2021)
  • 著者名/発表者名: 伊藤悦朗
  • 学会等名: 第94回日本生化学会大会
  • 招待講演