| 研究課題/領域番号 |
21H03060
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
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研究代表者 |
松尾 光一 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 教授 (40229422)
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| 研究分担者 |
河合 克宏 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (00553653)
黒田 有希子 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (70455343)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | 左右対称性 / 骨格 / 骨芽細胞 / 破骨細胞 / メカニカルストレス |
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| 研究実績の概要 |
「骨が左右対称性に形作られる形態形成の細胞機構は何か」に答えるために、「細胞キラリティ仮説」と「トランスペアリング仮説」を追究した。「細胞キラリティ仮説」は、“骨芽細胞には、鏡像の左手型細胞と右手型細胞が存在して、左右対称の骨格を形成している”というものである。2021年度は、新生仔マウスの頭蓋冠由来の骨芽細胞を用いた培養実験で、概念実証が進んだ。すなわち、左右の前頭骨と頭頂骨から調製した初代骨芽細胞は、すべて右手型細胞の割合が、左手型細胞の割合よりも有意に高かった。サンプル数を増やすために、半自動的な定量解析方法を確立することを目指し、複数の方向性と平行性を数値化するソフトウエアを検討した。計算原理や説明が充実していて、すでに多数の生命科学の論文に応用されているものを比較検討し、本研究に適合しているものを見出した。
また、「トランスペアリング仮説」は、 “皮質骨を挟んだ破骨細胞と骨芽細胞の対合メカニズム（トランスペアリング）が存在して、成長過程で左右対称性の周囲組織の形態に応答し、骨が左右対称性に変容しながら成長する”というものである。2021年度は、組織学的解析を中心に、脛骨と腓骨などの長管骨におけるトランスペアリングの現象を組織学的手法、Ｘ線イメージング、蛍光イメージングで解析し、最初の論文の投稿を行った。現象論が中心だったので、さらにメカニズムを深めるための改訂作業を進める必要があるという認識に至った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
「細胞キラリティ」について：概念実証が進み、スループットを上げて解析力を高めるための独自のアイデアに到達できた。PDMSスタンプを用いたマイクロプリンティングの手法には、ファイブロネクチンの「インク」の乾き具合の調節が重要であるものの、実験者の経験と勘に依存している。新たなアイデアで、研究室の中で誰もができる技術として確立する必要がある。一方、解析に用いる画像解析ソフトウエアの検証が進み、OrientationJというImageJという汎用的な画像解析ソフトウエアのプラグインが、比較した中で最も目的に合致していることがわかった。
「トランスペアリング」について：マウスの腓骨を中心に、骨芽細胞と破骨細胞の皮質骨を挟んだ分布を解析し、以前に報告した頭蓋底だけでなく（Edamoto et al, 2019, Sci Rep）、長管骨でも「トランスペアリング」が起こっているという現象を示すことができた。しかし、その具体的なメカニズムについては不明であり、2022年度以降に解明を目指す。
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| 今後の研究の推進方策 |
推進方策１（細胞キラリティ検出系の高度化）
フィブロネクチンのマイクロプリンティングの手法による、細胞培養レベルで右手型や左手型といった細胞のキラリティを検出する手法（Wan et al, 2011, PNAS）を、独自のアイデアで高度化し、スループットを上げて解析力を高める。具体的には、マイクロプリンティングのパターンをドーナツ型から直線の多い型にすること、PDMSスタンプにハンコのような持ち手を付けること、ステージ付きの電動ドリルの機構を利用して垂直にスタンプできるようにすることなどを検討する。
推進方策２（坐骨神経切除術を行ってトランスペアリングを解析する）
坐骨神経切除術を行うと、方向性をもったトランスペアリングが腓骨から消失することが分かった。その状態を対照群と比較しながらＸ線や蛍光を用いた3Dイメージングを行って、内向きトランスペアリングの方向や位置の制御メカニズムに、神経や筋肉、皮質骨を貫通する血管がどのように関わるのかを解明する。
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