超精密個別化ゲノム解析法の開発による遺伝性疾患の病因病態解明

2022 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 21H03548
• 配分区分: 補助金
• 研究機関: 関西医科大学
• 研究代表者: 日笠 幸一郎 関西医科大学, 医学部, 教授 (10419583)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2025-03-31
• キーワード: ヒトゲノム多様性

研究実績の概要

本年度も、ロングリード（長鎖）シークエンサーを用いて、高精度のヒトハプロイドゲノムを構築することを目的とし、２倍体ゲノムからの高分子DNAの抽出と解析を進めた。抽出法としてNanobindとpromega wizard kitを比較検討した。Nanobindでは、最頻値50kb強、平均40kbのDNAが約23ug、promegaでは、最頻値50kb弱、平均25kbのDNAが約10ug抽出され、Nanobindの方が、サイズ・収量ともに、良好な結果であった。Nanobindで抽出したDNA約7ugを使用してライブラリを作製し、Oxford Nanopore PromethIONを用いて、シークエンスを実施した。ライブラリ1は、総塩基数26.7Gb、リード数1.4M、N50=32.0kb、平均リード長18.8kb、ライブラリ2は、総塩基数41.1Gb、リード数5M、N50=16.6kb、平均リード長8.3kbであった。これらのシークエンスデータを用いてアセンブリーを実施し、コンティグN50=27.3Mb、最大値126.3Mb、平均4.1Mb、総塩基長が2.75Gbを得たことから、十分な質のDNAからシークエンスデータが得られていることが推察される。平均リード長が抽出したDNA断片長から期待される値よりも短い傾向があることから、NEB Monarch HMW DNA Extraction KitによるDNA抽出や、Ultra-Long DNA Sequencing Kit V14+R10.4 poreによるシークエンスの実施など、更なる検討を進める。日本人参照配列の高次元化に利用する全ゲノム情報については、解析が完了している3,000検体を約10,000検体まで拡充し、参照配列の構築に必要なゲノム上の構造変異情報の収集に努める。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本年度は、主に２倍体のDNAを用いてロングリードシークエンス解析を進めた。構築できた参照配列は、従来のヒトゲノム参照配列と比して遜色ないことから、当該データについてはHaplotype aware assemblyを実施し、ハプロタイプの構築精度の評価が可能である。高次元化に利用する全ゲノム情報についても拡充の目処がたち、日本人参照配列の構築に向けて順調に進んでいる。

今後の研究の推進方策

本年度は、２種類の高分子DNA抽出法と、Nanoporeシークエンサーを用いたロングリードシークエンス解析を進め、de novo assemblyによって日本人ゲノム配列を構築した。当該データについては更なる分析を進めると共に、更に高分子のDNAを抽出するプロトコルや改良された長鎖シークエンスkitの採用、PacBioの高品質長鎖配列の追加も検討し、精度の高い日本人参照配列の構築を目指す方針とする。また、日本人ゲノムの網羅性を高めるため、全ゲノム解析対象検体を1万検体まで追加し、解析する予定である。日本人由来ではないが、T2Tコンソーシアムから昨年4月に公開された最新のヒトゲノム参照配列との比較検討も今後の課題である。

研究成果

• [雑誌論文] Successful pregnancy and delivery in a young-onset hypertrophic cardiomyopathy patient with a novel doublet-base substitution in the MYH7 gene (2023)
  • 著者名/発表者名: Miyawaki Norihisa、Toyota Toshiaki、Higasa Koichiro、Nakamura Tomoyuki、Furukawa Yutaka
  • 雑誌名: Journal of Cardiology Cases 巻: 27 ページ: 8～11
  • DOI: 10.1016/j.jccase.2022.09.010
  • 査読あり
• [雑誌論文] Deep learning-based predictions of clear and eosinophilic phenotypes in clear cell renal cell carcinoma (2023)
  • 著者名/発表者名: Ohe Chisato、Yoshida Takashi、Amin Mahul B.、Uno Rena、Atsumi Naho、Yasukochi Yoshiki、Ikeda Junichi、Nakamoto Takahiro、Noda Yuri、Kinoshita Hidefumi、Tsuta Koji、Higasa Koichiro
  • 雑誌名: Human Pathology 巻: 131 ページ: 68～78
  • DOI: 10.1016/j.humpath.2022.11.004
  • 査読あり
• [雑誌論文] Areas of Crush Nuclear Streaming Should Be Included as Tumor Content in the Era of Molecular Diagnostics (2023)
  • 著者名/発表者名: Noda Yuri、Yamaka Ryosuke、Atsumi Naho、Higasa Koichiro、Tsuta Koji
  • 雑誌名: Cancers 巻: 15 ページ: 1910～1910
  • DOI: 10.3390/cancers15061910
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Multiple Pre-Treatment miRNAs Levels in Untreated Major Depressive Disorder Patients Predict Early Response to Antidepressants and Interact with Key Pathways (2022)
  • 著者名/発表者名: Kato Masaki、Ogata Haruhiko、Tahara Hidetoshi、Shimamoto Akira、Takekita Yoshiteru、Koshikawa Yosuke、Nishida Keiichiro、Nonen Shinpei、Higasa Koichiro、Kinoshita Toshihiko
  • 雑誌名: International Journal of Molecular Sciences 巻: 23 ページ: 3873～3873
  • DOI: 10.3390/ijms23073873
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Development and validation of a vascularity-based architectural classification for clear cell renal cell carcinoma: correlation with conventional pathological prognostic factors, gene expression patterns, and clinical outcomes (2022)
  • 著者名/発表者名: Ohe Chisato、Yoshida Takashi、Amin Mahul B.、Atsumi Naho、Ikeda Junichi、Saiga Kazuho、Noda Yuri、Yasukochi Yoshiki、Ohashi Riuko、Ohsugi Haruyuki、Higasa Koichiro、Kinoshita Hidefumi、Tsuta Koji
  • 雑誌名: Modern Pathology 巻: 35 ページ: 816～824
  • DOI: 10.1038/s41379-021-00982-9
  • 査読あり
• [雑誌論文] Accelerated Angiogenesis of Human Umbilical Vein Endothelial Cells Under Negative Pressure Was Associated With the Regulation of Gene Expression Involved in the Proliferation and Migration (2022)
  • 著者名/発表者名: Fukui Michika、Matsuoka Yuki、Taketani Shigeru、Higasa Koichiro、Hihara Masakatsu、Kuro Atsuyuki、Kakudo Natsuko
  • 雑誌名: Annals of Plastic Surgery 巻: 89 ページ: e51～e59
  • DOI: 10.1097/SAP.0000000000003298
  • 査読あり
• [雑誌論文] Multidimensional analyses of the pathomechanism caused by the non-catalytic GNE variant, c.620A>T, in patients with GNE myopathy (2022)
  • 著者名/発表者名: Yoshioka Wakako、Iida Aritoshi、Sonehara Kyuto、Yamamoto Kazuki、Oya Yasushi、Mori-Yoshimura Madoka、Kurashige Takashi、Okubo Mariko、Ogawa Megumu、Matsuda Fumihiko、Higasa Koichiro、Hayashi Shinichiro、Nakamura Harumasa、Sekijima Masakazu、Okada Yukinori、Noguchi Satoru、Nishino Ichizo
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 12 ページ: 21806~21806
  • DOI: 10.1038/s41598-022-26419-0
  • 査読あり
• [学会発表] マウス脊髄損傷へのイモリ型脊髄再生原理の導入へ向けて (2023)
  • 著者名/発表者名: 林真一、関亮平、大江総一、小池太郎、中野洋輔、伊藤健、安河内彦輝、日笠幸一郎、北田容章
  • 学会等名: 両生類研究センターバイオリソース棟落成記念シンポジウム
• [学会発表] マウス脊髄損傷へのイモリ型脊髄再生原理の導入へ向けて (2023)
  • 著者名/発表者名: 林真一、関亮平、大江総一、小池太郎、中野洋輔、伊藤健、安河内彦輝、日笠 幸一郎、北田容章
  • 学会等名: 日本解剖学会総会・全国学術集会
• [学会発表] マウス脊髄損傷へのイモリ型脊髄再生原理の導入へ向けて (2023)
  • 著者名/発表者名: 林真一、関亮平、大江総一、小池太郎、中野洋輔、伊藤健、安河内彦輝、日笠幸一郎、北田容章
  • 学会等名: 日本再生医療学会総会
• [学会発表] Multi-dimensional analyses of the pathomechanism of GNE myopathy with non-catalytic site variant, GNE: c.620A>T (2022)
  • 著者名/発表者名: Wakako Yoshioka, Aritoshi Iida, Kyuto Sonehara, Kazuki Yamamoto, Yasushi Oya, Madoka Mori-Yoshimura, Takashi Kurashige, Mariko Okubo, Megumu Ogawa, Fumihiko Matsuda, Koichiro Higasa, Shinichiro Hayashi, Harumasa Nakamura, Masakazu Sekijima, Yukinori Okada, Satoru Noguchi, Ichizo Nishino
  • 学会等名: Myology
  • 国際学会
• [学会発表] Gut microbiota as a factor underlying Kawasaki disease susceptibility (2022)
  • 著者名/発表者名: Yoshiki Teramoto , Shohei Akagawa , Yuko Akagawa , Shin-ichiro Hori , Sohsaku Yamanouchi , Shoji Tsuji , Koichiro Higasa , Kazunari Kaneko
  • 学会等名: International Human Microbiome Consortium 9thCongress
• [学会発表] 本邦のうつ病患者における疾患発症、重症度、薬物治療反応性に関するゲノムワイド関連解析（GWAS) (2022)
  • 著者名/発表者名: 島本優太郎, 安河内彦輝, 村瀬雄士, 越川陽介, 舩槻紀也, 緒方治彦, 嶽北佳輝, 木下利彦, 日笠幸一郎, 加藤正樹
  • 学会等名: BPCNPNPPP4学会合同年会
• [学会発表] 本邦のうつ病患者における疾患発症、薬物治療反応性に関するゲノムワイド関連解析（GWAS) (2022)
  • 著者名/発表者名: 島本優太郎, 安河内彦輝, 村瀬雄士, 越川陽介, 舩槻紀也, 緒方治彦, 嶽北佳輝, 木下利彦, 日笠幸一郎, 加藤正樹
  • 学会等名: 第41回躁うつ病の薬理・生化学的研究懇話会
• [学会発表] 本邦のうつ病患者と健常者サンプルを用いたゲノムワイド関連解析（GWAS） (2022)
  • 著者名/発表者名: 島本優太郎, 安河内彦輝, 村瀬雄士, 越川陽介, 舩槻紀也, 緒方治彦, 木下利彦, 日笠幸一郎, 加藤正樹
  • 学会等名: 第19回日本うつ病学会総会／第5回日本うつ病リワーク協会年次大会【合同開催】
• [備考] 世界で初めて網羅的にmiRNAを解析し抗うつ薬の予測に有用であることを示す
  • URL: https://www.kmu.ac.jp/news/laaes7000000kr5t-att/20220518Press_Release.pdf