研究課題
１．損傷部位にリクルートされるヒストン修飾酵素の解析： ヒストンメチル化酵素がDNA損傷部位にリクルートされる分子機構を理解するため、当該酵素の様々な欠失変異体をEGFP融合タンパク質として安定発現する細胞を作製して局所紫外線刺激を行った。その結果、これまで機能未知のN末端領域が損傷部位への集積に十分であることがわかった。さらに組換えタンパク質の発現・精製を行い、そのDNA結合活性が損傷によって増強されることを示す結果を得た。一方、ヒストン脱アセチル化酵素HDAC1/2に加えて、その活性促進因子として知られるMTAタンパク質が局所紫外線刺激に応答してDNA損傷部位に集積し、ヒストン脱アセチル化を誘導することが明らかになった。２．クロマチンとの相互作用を介したXPCの局在・動態制御機構の解析： XPC中央部の天然変性領域がヒストンH3のN末端テールと直接相互作用し、ヒストンテールのアセチル化によってこの相互作用が著しく減弱することを見出した。さらにこの中央領域を欠失した変異XPCは無細胞NER反応系では正常な活性を示す一方、細胞内では野生型XPCに比べて活性が低下することがわかった。さらに、LacO-LacRシステムを用いてHDACのテザリングを行い、HDACの活性依存的にXPCをLacOアレイにリクルートできることを示した。３．XPCのゲノムワイドな局在制御と損傷修復効率の相関： A549細胞を用いてXPC及びヒストン修飾を標的とするクロマチン免疫沈降シーケンス（ChIP-seq）解析を行い、クロマチン上におけるXPCとメチル化ヒストンの局在が正の相関を示す可能性を見出した。
2: おおむね順調に進展している
１．損傷部位にリクルートされるヒストン修飾酵素の解析： ヒストンメチル化酵素に関しては、DNA損傷部位へのリクルートに関わる領域の同定に成功した。XPC及びDDB2に依存せずにヒストンメチル化酵素が損傷部位にリクルートされるメカニズムの解明が重要な課題の一つであったが、ヒストンメチル化酵素自身がDNAの構造異常を認識する能力を持つ可能性を見出したことは大きな進展である。HDAC1/2がMTAとの複合体として損傷部位にリクルートされることも示しており、この部分の研究は概ね順調に進展している。２．クロマチンとの相互作用を介したXPCの局在・動態制御機構の解析： これまで機能未知であったXPCの中央領域がアセチル化を介したヒストンテールとの直接相互作用を担い、細胞内のNERの促進に寄与するというのは、様々な修飾を含むヒストンとの相互作用を解析して上で極めて重要な発見と言える。また、テザリングアッセイの結果は、ヒストンのアセチル化状態を操作することでXPCの核内局在を人為的に制御できることを示した画期的な知見である。この部分の研究は当初の計画以上に進展が見られている。３．XPCのゲノムワイドな局在制御と損傷修復効率の相関： クロマチン上におけるXPCとメチル化ヒストンの局在相関はヒストンメチル化酵素の役割から期待された結果と合致しており、この部分の研究の進捗は概ね順調と考えている。以上、本研究計画全体としては、概ね順調に進展していると言える。
１．損傷部位にリクルートされるヒストン修飾酵素の解析： ヒストンメチル化酵素のDNA結合活性の特異性をさらに詳細に解析し、どのようなDNAの構造異常を認識しているのかを明らかにする。当該酵素の全長タンパク質及び複合体としての発現・精製も行い、DNA結合活性とその特異性を比較解析する。またHDAC複合体については既知の構成サブユニットの発現抑制や変異体作製により、DNA損傷部位へのリクルートを担う因子・ドメインの特定を目指す。２．クロマチンとの相互作用を介したXPCの局在・動態制御機構の解析： XPCの中央領域とヒストンテールの相互作用が、ヒストンテールのメチル化によって増強されるかどうかを調べる。XPC中央領域でこの相互作用に関与する領域を絞り込むとともに、構造生物学的な手法も駆使して詳細な相互作用の解析を行う。さらに、HDACとメチル化酵素を同時にテザリングした場合のXPCの局在に対する相乗効果の有無を検証する。３．XPCのゲノムワイドな局在制御と損傷修復効率の相関： ChIP-seq解析を繰り返し行い、XPCとメチル化ヒストンの局在相関の有意性を統計的に評価する。さらに様々なヒストン修飾のゲノムワイド分布に関するデータベースを参照し、XPCの局在制御に関わるヒストン修飾パターンを明らかにする。さらに、通常培養条件でXPCが局在しやすい遺伝子領域が、紫外線照射時に優先的に修復されるかどうかを検討する。
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iScience
巻: 25 ページ: 104040
10.1016/ j.isci.2022.104040
https://www.research.kobe-u.ac.jp/brce-sugasawa/
