| 研究実績の概要 |
Azaserineの生合成機構の解析に関して
昨年度の研究から、O-(2-hydrazineylideneacetyl)serineが中間体と示唆されたため、この化合物を基質として、生合成遺伝子クラスター中の酸化酵素を利用してin vitroアッセイを行ったが、反応の進行を確認することができなかった。そこで、azaserineと類似した構造を持つ天然物を生産する菌に着目し、そのゲノム解析を実施した。その結果、azaserine生合成遺伝子クラスターとよくにた生合成遺伝子クラスターが見出された。この遺伝子クラスターとの比較からazaserineの生合成においてジアゾ基の生合成を担う酵素を見出すことができた。また、エステル結合形成を触媒する非リボソームペプチド合成酵素、AzsOの持つヘテロ環化ドメインのX線結晶構造解析に成功した。また、部位特異的変異導入の結果と合わせてエステル結合メカニズムに関して知見を獲得した。
2,4-ジアミノ-3-ヒドロキシ安息香酸の生合成機構に関して
昨年度実施した異種発現により、2-アミノ-3-ヒドロキシ安息香酸が、亜硝酸、3つの酵素 (NybC, N, O) とにより2,4-ジアミノ-3-ヒドロキシ安息香酸へと変換されることを見出した。これらのin vitro解析を試みた。その結果、NybOは2-アミノ-3-ヒドロキシ安息香酸を亜硝酸依存的にジアゾ化することが明らかとなった。さらに、NybCはこれにより作られたジアゾ化合物を還元することが明らかになった。これらの反応解析から、当初予想していたものとは異なる、2,4-ジアミノ-3-ヒドロキシ安息香酸生合成経路が示唆された。
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| 今後の研究の推進方策 |
まず、azaserine類縁体の生合成に関しては生合成遺伝子クラスターの異種発現を実施することで目的クラスターであることを確認する。生産物を同定するためにazaserine類縁体の有機合成による調製も並行して試みる。また、ジアゾ基生合成直前の基質と考えられる化合物を有機合成により調製する。得られた基質を用いてジアゾ基合成酵素のin vitro機能解析を実現する。また、ジアゾ基合成酵素のX線結晶構造解析を実施する。得られた構造をもとに部位特異的変異導入を実施することで反応機構を調べる。また、NybNの機能をin vitroで解析することで、2,4-ジアミノ-3-ヒドロキシ安息香酸生合成経路の全体を明らかにする。NybO, N, CのX線結晶構造解析を試みることでこれらの酵素の反応メカニズムの解明を目指す。
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