研究課題
アーバスキュラー菌根菌（AM菌）の完全な単独培養法を確立するため、以下の2つの課題を検討した。課題１．胞子成熟化因子の特定：モデルAM菌であるRhizophagus irregularisをミリスチン酸を含む培地で培養すると、バイオマスは増加するが次世代胞子のサイズは親胞子に比べて小さいという課題がある。ある種のAM菌は単独培養によっても次世代胞子の約半数が親胞子と同等のサイズになる。胞子の成熟因子の同定のため、この菌種のゲノム解読を試みた。しかし、培養菌体から抽出したゲノムDNAは微量あり、しかも著しく断片化していたことから、PacBio Sequel IIによるシーケンス解析を行うことができなかった。そこで、de novo transcriptome解析により発現遺伝子のカタログ化を行った。十分なリード数が得られたことから、Trinityを用いてde novo assembleを行った。次年度は、モデルAM菌R. irregularisのゲノム・トランスクリプトームデータと比較することで、胞子成熟化に関わる遺伝子候補を抽出する。オミクス解析と並行して、ケミカルライブラリースクリーニングによる胞子成熟化因子の探索を行い、マイクロプレートを用いたスクリーニング系の構築を行った。課題２．高増殖効率を示す脂肪酸の探索：植物から供給される脂肪酸の種類と量を明らかにするため、ミヤコグサ共生変異体（gpdh変異体）に安定同位体標識グルコースを投与し、クロマトグラフィー質量分析計で脂質組成を解析した。これらの解析をもとに脂肪酸の組み合わせや濃度を変えて単独培養の培地に添加し、AM菌の増殖速度や胞子生産量を評価し、培養の最適化を行った。不飽和脂肪酸の一部が増殖に対して高い効果を示すことが明らかとなった。
2: おおむね順調に進展している
単独培養で成熟化を示す菌種のゲノム解読については、当初PacBioシーケンサーによる解析を予定していたが、培養菌体から得られるDNA量が極めて少なく解析が困難であったため、de novo transcriptome解析による発現遺伝子レパートリーの抽出に切り替えた。最終的に17万のトランスクリプト配列が得られたことから、当初目的としていたR. irregularisとの比較ゲノムには利用できると考えられる。ケミカルライブラリースクリーニングについては、アッセイ系の確立を行った。当初は80種類の化合物を用いて系を確立することを予定していたが、数種類の化合物を用いてアッセイ系を確立した。植物の共生変異体を用いた脂質解析については、トリアシルグリセロールやモノアシルグリセロールの解析の一部が終了し、引き続きその他の脂質の分析や安定同位体の分析を行っているところである。また、脂肪酸の組み合わせによるAM菌の単独培養については、不飽和脂肪酸が増殖に効果的であることを見出しており、順調に試験が進んでいる。
胞子成熟化因子の探索における比較ゲノム関しては、ゲノム解読には至らなかったものde novo transcriptomeによる発現遺伝子のデータが得られたことから、今後はこのデータを用いて遺伝子レパートリーの比較を行う。また、この解析と並行して、ケミカルライブラリースクリーニングを引き続き行い、胞子成熟化に関与する物質を探索する。高増殖効率を示す脂肪酸の探索については、植物の共生変異体の脂質分析に先行して、AM菌の増殖に対する混合脂肪酸の効果の解析が進んでいる。しかし、植物から供給される脂質の特定は重要であり、AM菌の増殖に高い効果を示すものが存在する可能性がある。引き続き、共生変異体の解析を進めていく。次年度はこれらの解析に加えて、純粋培養系を用いたAM菌の形質転換系を確立するため、エレクトロポレーション法を検討する。
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巻: 3 ページ: 8-10
作物生産と土つくり
巻: 54 ページ: 20-24
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