研究課題
本研究はサケ科魚類をモデルとして、成長調節に関わる数種のホルモン・タンパク質の機能を明らかにし、それらを感度と方向性が異なる指標として組み合わせて、増養殖魚の成長とストレスを高精度で診断することを目的としている。本年度は以下の成果を得た。インスリン様成長因子（IGF）-1とIGF結合タンパク（IGFBP）-2bについて大腸菌発現系を用いて組換えタンパクの作製を行った。まずチオレドキシンとヒスチジンタグを融合パートナーとした組換えサケ（rs）IG-1とIGFBP-2bを発現させた。そして、rsIGF-1についてはトロンビンによる酵素処理を行って融合パートナーを切断し、逆相クロマトグラフィーにより精製した。一方、rsIGFBP-2bは融合パートナーを付けた状態でアフィニティー精製した。ゲノム編集実験については、研究協力者が所属する米国冷水養殖研究所にて、ニジマスIGFBP-2bのF1ノックアウト（KO）F1個体を作出した。得られた血清を解析したところIGFBP-2bバンドの消失が確認された。上述の融合パートナーが付加されたrsIGFBP-2bを用いて、時間分解蛍光免疫測定系（TR-FIA）の確立を行った。給餌もしくは絶食した個体標識ニジマスより得られた血清を解析したところ、血中IGFBP-2b量は絶食により減少し、個体の成長率と正の相関を示した。このことから、血中IGFBP-2bは成長の指標として使用可能であると考えられた。他魚種への展開については、研究協力者がニホンウナギ仔魚においてigfとigfbpのmRNA量を定量し、絶食に対する反応を調べた。結果、igf-1は予想に反して絶食個体で高かった。一方、igfbp-1aはサケ科魚類と同様に絶食で増加した。これらのことからigfの絶食に対する反応は魚種もしくは発達ステージにより異なることが示唆された。
2: おおむね順調に進展している
本年度の大きな目標として、組換えIGFBP-2bを作製し、それを用いてTR-FIAを確立することがあり、それを達成できた。IGFBP-2bの定量は、精製品を用いたラジオイムノアッセイの稼働ができなくなって以来10年以上行われておらず、本TR-FIAにより今後のIGFBP-2bの生理学的解析が加速することが期待される。成果は学会発表するとともに、国際誌に投稿中である。加えて、IGFBP-1bに関して、血中でIGF結合能を持つ画分のみを測定する機能性リガンド免疫測定法系（LIFA）の確立も行った。こちらも成果を学会発表し、国際誌に投稿中である。また、米国の研究協力者と共同でゲノム編集によりIGFBP-2bを欠失した系統を世界に先駆けて確立することに成功した。この系統を用いることで、IGF-1とIGFBP-2bによる成長調節メカニズムの詳細な解析が可能となった。研究協力者がニホンウナギ仔魚においてIGF-1の生理学的反応が異なることを見出し、このような特異性を踏まえて本種の種苗育成を行う重要性が指摘された。これらのことから、「おおむね順調に進行している」と判断した。
本年度は融合パートナーを付した組換えIGF-1を作製したが、その酵素的切断過程において収率が落ちてしまうことが明らかになった。今後、酵素の認識配列を変更したり、尿素による前処理を行って特異性を高めるなどして収率向上を目指す。この条件を取り入れ、組換えIGF-2とIGFBP-2aの作製を行う予定である。本年度はIGFBP-2bのTR-FIAを確立したが、今後、LIFAの確立を行い、IGF結合能を持つ画分の割合や成長との関係を調べる。そして、IGFBP-2bの成長指標としての感度の向上が可能か否か検討する。また、今後、IGF-2のTR-FIAの確立を行うが、市販の抗血清を用いた予備実験では抗体価が弱いことが考えられたので、改めて抗血清を作製することも検討する。ゲノム編集については、IGFBP-2b KO系統が確立できたので、米国の研究協力者と共に本系統を用いた各種飼育実験を行い、IGFBP-2bの成長に果たす役割を明らかにする。また、IGFBP-2aのゲノム編集も行う予定である。
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すべて 国際共同研究 (2件) 雑誌論文 (3件) (うち国際共著 1件、 査読あり 3件) 学会発表 (5件) (うち国際学会 2件) 備考 (1件)
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https://www.fishendocrinology.com/
