試験管内再構成による姉妹染色分体間接着形成機構の理解

2022 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 22H02550
• 配分区分: 補助金
• 研究機関: 国立遺伝学研究所
• 研究代表者: 村山 泰斗 国立遺伝学研究所, 遺伝メカニズム研究系, 准教授 (60531663)
• 研究期間 (年度): 2022-04-01 – 2025-03-31
• キーワード: 姉妹染色分体間接着 / 染色体分配 / コヒーシン / 生化学

研究実績の概要

細胞分裂における正確な染色体の分配は、染色体ペアの間に形成される接着構造に依拠する。コヒーシンはリング構造のATPase複合体で、リング内にDNAを通すトポロジカルDNA結合を介して接着を形成すると考えられている。接着はDNA複製の最中に形成されることが知られるが、その形成メカニズム及び接着の分子構造は未だ不明である。本研究は、精製した出芽酵母のコヒーシン及びDNA複製因子を用いて、複製に共役した接着形成過程を試験管内で再構築することで、その分子機構の解明を目指すものである。
2022年度は、コヒーシンとDNA複製反応を共役させ、その応答について詳細に解析した。まず DNA複製に対するコヒーシンの影響を調べるため、複製開始点を持つ環状の基質DNAにコヒーシンを先にローディングさせ、次に複製反応を行ったところ、複製反応そのものにコヒーシンは影響が見られなかった。この反応後、免疫沈降法でコヒーシンを回収し結合DNAを解析したところ、コヒーシンは複製が完了した産物と結合し続けていたことが判明した。改変コヒーシンを用いた解析から、複製DNAとの結合はコヒーシンのリング構造に依拠するトポロジカル結合を介することがわかった。一方で、複製反応後にコヒーシンを添加した場合は、複製DNAとの結合量は大幅に低下した。興味深いことに、出芽酵母の代わりに分裂酵母のコヒーシンを用いた場合でも、同様の結果が得られた。これらから、コヒーシンがDNAに結合し続けた状態で、DNA複製反応は開始から完了まで起こったと結論した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

コヒーシンとDNA複製因子を合わせ25種類以上の精製タンパク質・複合体を共役させるとことで、DNA複製に対するコヒーシンの初期応答を検出した。現状、この再構成で接着が形成されている直接証拠は得られていないものの、さらなる解析を進めることで接着形成の基本原理に迫れるものと期待される。

今後の研究の推進方策

上記結果の最もシンプルな解釈は、DNAに結合するコヒーシンを超えて複製が完了したというものである。その場合、現状の再構成で複製された姉妹DNAの間で接着が形成されている可能性がある。そこで、複製DNAに結合したコヒーシンを精製し、その分子構造を高速原子間力顕微鏡により可視化する。並行して、姉妹染色分体間接着の形成に機能することが知られる複製装置結合タンパク質 (Ctf4, Csm3/Tof1, Chl1, Mrc1, Ctf18複合体, Eco1) を加え、コヒーシンに対する効果について解析を進める。

研究成果

• [学会発表] Regulation of the cohesin complex during DNA replication (2023)
  • 著者名/発表者名: Yasuto Murayama
  • 学会等名: Sussex Japan Genome Stability Meeting
  • 国際学会
• [学会発表] Real-time structural imaging of the chromosomal cohesin complex (2022)
  • 著者名/発表者名: Yumiko Kurokawa、Yasto Murayama.
  • 学会等名: 第74回日本細胞生物学会大会 「2A-102 Chromosome structure and genome modality」
  • 招待講演
• [学会発表] Cohesin’s response to DNA replication in vitro (2022)
  • 著者名/発表者名: Yasuto Murayama
  • 学会等名: Genome organization by SMC complexes (Biochemical Society)
  • 国際学会