| 研究課題/領域番号 |
22H02576
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究機関 | 関西学院大学 |
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研究代表者 |
沖米田 司 関西学院大学, 生命環境学部, 教授 (90398248)
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| 研究分担者 |
高橋 宏隆 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 准教授 (70432804)
福田 亮介 関西学院大学, 生命環境学部, 助教 (90825308) [辞退]
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | ERAD / retrotranslocation / 小胞体品質管理 / 膜タンパク質 / ユビキチン |
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| 研究実績の概要 |
A-1. 新規ERADモデル基質の構築と分解機構の解明：ERAD-M基質Insig-1，ERAD-C基質ABCB1のERADをリアルタイムに追跡するHiBiT assayを確立した．また，Insig-1については，HiBiT tagの位置を小胞体内腔に変えることで，そのretrotranslocationのリアルタイム定量が可能となった．
A-2. 多重機能阻害実験による逆輸送関連分子の作用点解明: RNF5/RNF185二重欠損細胞を用いた解析により，細胞質のHECT型E3 ligase UBE3CおよびHERC3がRNF5/185経路とは独立してCFTR変異体のERADを促進することを明らかにした．本研究成果は，国際誌Cells (DOI: 10.3390/cells12232741)およびJ Cell Biol (DOI: 10.1083/jcb.202308003) に受理された．さらに，多様なERADモデル基質を用いた解析により，RNF5, RNF185, HERC3はERAD-C基質 (CFTR, ABCB1) のretrotranslocationおよびERADを選択的に促進することを明らかにした．
B-1. NanoBiT法による逆輸送分子の基質結合解析: NanoBiT法により，CFTR変異体との結合に関わるRNF185内の相互作用領域の候補を見出した．今後，精製タンパク質を用いたin vitro結合解析により，直接的な結合について解析する予定である．
C-1. プロテオリポソームを用いた逆輸送機構の解析: 無細胞合成系により，CFTR含有プロテオリポソームの調製に成功した．AlphaScreenによる結合実験の結果，HERC3はリポソーム中のCFTR膜貫通領域と結合しないが，リポソーム外に出ると結合することを見出した．従って，HERC3は膜から露出したCFTR膜貫通領域を認識すると考えられる．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ほぼ予定通りに研究成果が得られており，UBE3CとHERC3に関する知見については，２報の査読付き原著論文（Kamada et al, Cells 2024 & Kamada et al, J Cell Biol 2024）として受理されたため．
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| 今後の研究の推進方策 |
1. 無細胞タンパク質合成系と共に，大腸菌タンパク質発現系を用いたin vitro結合実験も進め，逆輸送関連分子とERADモデル基質との相互作用機構を明らかにする．
2. 新たに確立したTCRalpha-TM-HiBiTキメラ分子を用いたERADリアルタイム定量解析により，逆輸送分子が認識する最小配列（デグロン）に起因するERAD促進効果が，逆輸送分子機能阻害で抑制されるか否かを明らかにする．本解析により，逆輸送分子によるERAD制御の基質選択性について知見を得る．
3. RNF5/RNF185二重欠損細胞で発現増加したE3リガーゼの機能解析も進め，論文発表まで進める．
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